Übersicht
Die quantitative Proteomik zielt darauf ab, Veränderungen der Proteinhäufigkeit unter verschiedenen biologischen Bedingungen zu messen. Im Gegensatz zur qualitativen Identifizierung, die lediglich das Vorhandensein eines Proteins nachweist, zeigt die Quantifizierung, wie das Proteom auf Reize, Krankheiten oder Behandlungen reagiert. Zwei umfassende Strategien dominieren das Feld: markierungsbasierte Methoden, die stabile Isotopenmarkierungen in Proteine oder Peptide einführen, und markierungsfreie Methoden, die aus spektralen Zählungen oder Ionenintensitäten auf die Häufigkeit schließen. Bei jedem Ansatz müssen Kompromisse zwischen Genauigkeit, Multiplexkapazität, Kosten und experimenteller Komplexität eingegangen werden, sodass die Wahl der Methode stark von der gestellten biologischen Frage abhängt.
Methoden
Zu den Techniken zur Markierung stabiler Isotope gehören SILAC (metabolische Markierung in Zellkulturen), TMT und iTRAQ (isobare Markierungen für relative und absolute Quantifizierung) sowie Dimethylmarkierung. Diese führen definierte Massenverschiebungen ein, die das Massenspektrometer unterscheiden kann, und ermöglichen so eine Multiplex-Analyse von bis zu 16 Proben in einem einzigen Lauf. Markierungsfreie Quantifizierung verwendet entweder die Anzahl der identifizierten Spektren (Spektralzählung) oder den extrahierten Ionenchromatogrammbereich jedes Peptids (MS1-Intensität). Datenunabhängige Erfassungsmethoden (DIA) wie SWATH-MS kombinieren eine umfassende Proteomabdeckung mit quantitativer Präzision über große Probenkohorten hinweg.
Praktisches Protokoll
Ein SILAC-basiertes quantitatives Proteomik-Experiment beginnt mit der metabolischen Markierung. Die Zellen werden entweder in „leichtem“ (Arg-0, Lys-0) oder „schwerem“ (Arg-10, Lys-8) Medium für mindestens fünf Zellverdoppelungen kultiviert, um eine vollständige Integration zu erreichen. Leichte und schwere Zellen werden unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt – zum Beispiel einer Inhibitorbehandlung oder einer Vehikelkontrolle. Nach der Lyse werden die Proteine im Verhältnis 1:1 basierend auf der Gesamtproteinkonzentration kombiniert, mit Trypsin verdaut und durch einfache Umkehrphasen-HPLC in 12–24 Fraktionen fraktioniert. Jede Fraktion wird mittels LC-MS/MS auf einem hochauflösenden Massenspektrometer analysiert. Das Instrument erkennt Paare von Peptidpeaks, die durch die durch die schweren Markierungen verursachte Massenverschiebung getrennt sind. Die Quantifizierung erfolgt auf MS1-Ebene: Die Software extrahiert Ionenchromatogramme für jedes Peptidpaar und berechnet das Schwer-zu-Leicht-Verhältnis. MaxQuant verarbeitet die Rohdateien und die resultierenden Proteinverhältnisse werden normalisiert, indem das mittlere log2-Verhältnis auf Null zentriert wird, wodurch kleinere Mischungsfehler korrigiert werden. Ein Zwei-Stichproben-t-Test oder eine ANOVA mit Benjamini-Hochberg-Korrektur identifiziert sich signifikant verändernde Proteine. Bei TMT-basierten Experimenten erfolgt die Markierung auf Peptidebene nach dem Verdau, und die Quantifizierung nutzt Reporterionenintensitäten in MS/MS-Spektren, was einen Multiplex-Vergleich von bis zu 16 Proben gleichzeitig ermöglicht. In einer bahnbrechenden Anwendung quantifizierte die TMT-basierte quantitative Proteomik 10.000 Proteine in 10 Brustkrebszelllinien und enthüllte die koordinierte Regulierung von Stoffwechselwegen, die mit der onkogenen Signalübertragung verbunden sind. SILAC wurde verwendet, um die Tyrosin-Phosphoproteom-Reaktion auf die Behandlung mit Imatinib in chronisch-myeloischen Leukämiezellen zu profilieren und dabei sowohl die Zielbindung als auch die Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu identifizieren.
Anwendungen
Quantitative Proteomik wird häufig bei der Entdeckung von Biomarkern eingesetzt und vergleicht die Proteinspiegel zwischen gesunden und erkrankten Geweben, um diagnostische oder prognostische Signaturen zu identifizieren. Bei der Arzneimittelentwicklung werden Zieleingriffe und Off-Target-Effekte profiliert. Die Integration quantitativer Daten mit der Validierung von ELISA und Western Blot gewährleistet Robustheit. Methoden wie die auf Massenspektrometrie basierende Quantifizierung ergänzen herkömmliche gelbasierte Ansätze wie SDS-PAGE und Kapillargelelektrophorese (CGE) und bieten eine tiefere Abdeckung und einen höheren Durchsatz.
