Übersicht
Top-Down-Proteomik analysiert intakte Proteine mittels Massenspektrometrie ohne vorherige enzymatische Verdauung. Im Gegensatz zum herkömmlichen Bottom-up-Ansatz, bei dem aus Peptiden Proteinidentitäten abgeleitet werden, misst die Top-down-Proteomik die intakte Masse eines Proteins und fragmentiert es anschließend im Massenspektrometer, um Sequenzinformationen zu erhalten. Dieser Ansatz bewahrt den vollständigen Proteinkontext, was bedeutet, dass Kombinationen aus posttranslationalen Modifikationen, Sequenzvarianten und alternativen Spleißformen – zusammenfassend als Proteoformen bezeichnet – als unterschiedliche molekulare Spezies beobachtet werden. Die Top-Down-Proteomik bietet daher einen direkten und eindeutigen Blick auf die Proteoformenlandschaft, der für Bottom-Up-Methoden weitgehend unsichtbar ist.
Methoden
Intakte Proteinionen werden durch Elektrospray-Ionisation in das Massenspektrometer eingebracht, wodurch eine Ladungszustandshülle erzeugt wird, aus der die Molekülmasse berechnet wird. Fragmentierung wird mithilfe von Techniken wie der Elektroneneinfangdissoziation (ECD) oder der Elektronentransferdissoziation (ETD) erreicht, die vorzugsweise das Proteinrückgrat spalten und gleichzeitig labile Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung erhalten. Die Identifizierung von Proteoformen basiert auf Algorithmen, die die gemessene intakte Masse und die Fragmentionen mit einer Datenbank vorhergesagter Proteoformen abgleichen. Ultrahochauflösende Massenspektrometer wie Fourier-Transform-Ionenzyklotronresonanz (FT-ICR) und Orbitrap-Instrumente sind für die Auflösung der kleinen Massenunterschiede zwischen verwandten Proteoformen unerlässlich.
Praktisches Protokoll
Ein praktischer Top-Down-Proteomik-Workflow beginnt mit der Extraktion intakter Proteine unter denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von 8 M Harnstoff oder 5 % SDS, um eine vollständige Solubilisierung sicherzustellen. Proteine werden auf der intakten Ebene mittels Umkehrphasen-HPLC oder Kapillarzonenelektrophorese (CZE) getrennt, die über Elektrospray-Ionisation an ein hochauflösendes Orbitrap- oder FT-ICR-Massenspektrometer gekoppelt ist. Das Instrument erfasst einen vollständigen MS-Scan über einen weiten Massenbereich (m/z 400–2.000) und erstellt so eine Ladungszustandshülle für jede Proteinart. Der Forscher entfaltet die Hülle mithilfe von Algorithmen wie MS-Deconv oder UniDec, um die neutrale monoisotopische Masse mit einer Genauigkeit im Sub-Da-Bereich zu berechnen. Zur Fragmentierung wird der am häufigsten vorkommende Ladungszustand mithilfe der Elektronentransferdissoziation (ETD) isoliert und dissoziiert, wodurch labile Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung erhalten bleiben. Die resultierenden Fragmentspektren werden mithilfe von ProSightPC oder TopPIC mit einer Datenbank vorhergesagter Proteoformen abgeglichen, die sowohl die intakte Masse als auch die Fragmentionen mit spezifischen Proteoformen abgleichen, die durch Sequenz, Modifikationen und Sequenzvarianten definiert sind. Die Quantifizierung erfolgt durch Vergleich der relativen Intensitäten der Ladungszustandshüllkurven unter verschiedenen Bedingungen. In einer wegweisenden Studie charakterisierte die Top-Down-Proteomik über 3.000 Proteoformen aus menschlichen Zellen, darunter allein 150 verschiedene Arten des Histon-H4-Proteins, die jeweils unterschiedliche Kombinationen von Methylierungs- und Acetylierungsmarkierungen tragen. Eine weitere Anwendung ist die Analyse von Antikörper-Proteoformen: Top-Down-MS deckte über 100 verschiedene monoklonale Antikörpervarianten aus einer einzigen Produktionscharge auf, was die Qualitätskontrolle in der biopharmazeutischen Herstellung ermöglicht und die Konsistenz therapeutischer Antikörper von Charge zu Charge gewährleistet.
Anwendungen
Die Top-Down-Proteomik zeichnet sich durch die Charakterisierung von [posttranslationalen Modifikationen] (/guides/post-translational-modifications.html) und ihren kombinatorischen Mustern an einzelnen Proteinen aus. Es wird zur Untersuchung von Histonmodifikationscodes, Antikörperheterogenität und Proteinabbauprodukten verwendet. Der Ansatz ergänzt die Bottom-up-Proteomik und Massenspektrometrie und profitiert von der gleichen Massenspektrometrie Instrumentierung und bietet gleichzeitig einzigartige Einblicke in die Proteoformbiologie, die für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung von Präzisionstherapien von entscheidender Bedeutung sind.
