La PCR de colonias es una técnica de detección rápida que se utiliza para determinar si las colonias bacterianas contienen un plásmido con el inserto de ADN correcto. En lugar de purificar primero el ADN plasmídico de cada colonia, la PCR se realiza directamente en una pequeña cantidad de células bacterianas.
Cómo funciona la PCR de colonias
- Selección de colonia
Las colonias bacterianas individuales que crecen en una placa de agar se recogen utilizando una punta de pipeta estéril o un palillo de dientes. Cada colonia se toca brevemente, transfiriendo una pequeña cantidad de células. Se utiliza la misma punta para inocular tanto el tubo de PCR como una placa maestra para su posterior cultivo.
- Lisis celular
Las células bacterianas se calientan a 95°C durante varios minutos durante el paso de desnaturalización inicial de la PCR. Este tratamiento térmico lisa las células, liberando el ADN plasmídico en la mezcla de reacción. El ADN liberado sirve entonces como plantilla para la amplificación.
- amplificación por PCR
Se utilizan cebadores que flanquean la región de inserción en el plásmido. Si la colonia contiene un plásmido con el inserto correcto, la PCR producirá una banda del tamaño esperado. Si el plásmido está vacío (sin inserto), la banda será más pequeña. Si la colonia no contiene ningún plásmido, no se producirá ninguna banda.
- Análisis de gel
Los productos de la PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Las colonias que producen una banda del tamaño de inserción esperado se identifican como positivas. Estas colonias luego se pueden cultivar para purificación del plásmido y análisis posteriores.
- Ventajas
La PCR de colonias es rápida y económica, lo que permite examinar decenas de colonias en unas pocas horas. Elimina la necesidad de purificar el plásmido antes de la detección y es un primer paso estándar en los flujos de trabajo de clonación molecular.
Protocolo práctico de PCR de colonias
Elija colonias bacterianas individuales de una placa de agar selectiva utilizando una punta de pipeta estéril de 10 l. Toque ligeramente una sola colonia; evite transferir un gran grupo de células. Coloque la punta en una placa maestra nueva (agar LB rallado con antibiótico) para preservar el clon, luego sumerja y agite la misma punta en un tubo de PCR que contenga 20–25 µl de mezcla maestra. Para cada colonia, prepare la mezcla: 12,5 l de mezcla maestra de PCR 2x, 0,5 l de cada uno de cebadores directos e inversos (10 m), 1 l de plantilla (la colonia) y agua hasta 25 l. Utilice cebadores específicos de vector que flanquean el inserto (por ejemplo, M13 adelante/inverso o T7/SP6) o cebadores internos específicos del inserto. Ejecute la PCR con una desnaturalización inicial prolongada a 95 °C durante 5 a 10 minutos para garantizar la lisis bacteriana completa y la liberación de ADN. Siga de 30 a 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min por kb de inserto esperado, con una extensión final a 72 °C durante 5 minutos. Analizar 5-10 l de cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa. Una banda con el tamaño de inserción esperado indica un clon positivo. Si no aparece ninguna banda, es posible que a la colonia le falte el plásmido, contenga un vector vacío (lo que produce una banda más pequeña) o que la lisis haya sido insuficiente: reduzca la cantidad de células bacterianas transferidas. Para bacterias Gram positivas rebeldes, agregue 0,5 µL de lisozima (50 mg/mL) a la mezcla de PCR o realice una lisis de congelación y descongelación antes de la PCR.
Aplicación del mundo real
Cuando se clona un casete de expresión de GFP de 1,2 kb en pET-28a, los transformantes se siembran en placas sobre agar kanamicina. De 24 colonias seleccionadas mediante PCR de colonias con cebadores promotor y terminador T7, 18 muestran una banda de 1,2 kb, 4 muestran la banda del vector vacía (300 pb) y 2 no producen ninguna banda. Los 18 clones positivos se utilizan para la purificación y secuenciación de plásmidos, lo que confirma una clonación exitosa en menos de 4 horas.
