La purificación de plásmidos, también conocida como miniprep, es una técnica utilizada para aislar pequeñas moléculas circulares de ADN (plásmidos) de células bacterianas. Los plásmidos se utilizan comúnmente como vectores en clonación molecular, y purificarlos es esencial para la secuenciación, la transfección y la manipulación posterior.
Cómo funciona la purificación de plásmidos
- cultivo bacteriano
Se cultiva una única colonia bacteriana que contiene el plásmido deseado durante la noche en medio líquido con el antibiótico apropiado. Esto asegura que las bacterias mantengan el plásmido y produzcan suficiente para la extracción.
- recolección de células y lisis
El cultivo bacteriano se centrifuga para sedimentar las células. El sedimento se resuspende en un tampón que contiene RNasa (para digerir el ARN) y luego se trata con una solución de lisis alcalina que contiene SDS e hidróxido de sodio. Esto rompe las células y desnaturaliza el ADN.
- Neutralización
Se añade un tampón de neutralización que contiene acetato de potasio. La alta concentración de sal hace que el ADN cromosómico desnaturalizado y las proteínas precipiten, mientras que el ADN plasmídico superenrollado, más pequeño, permanece en solución. La mezcla se centrifuga y se recoge el sobrenadante que contiene el plásmido.
- Encuadernación y lavado
El sobrenadante se pasa a través de una columna de membrana de sílice en condiciones que provocan la unión del ADN plasmídico. Un tampón de lavado elimina los contaminantes restantes, como sales, proteínas y ARN.
- elución
El ADN plasmídico purificado se libera de la membrana utilizando un tampón bajo en sal o agua. El ADN resultante es lo suficientemente puro para la secuenciación, la digestión de restricción o la transfección de células eucariotas.
Protocolo práctico de minipreparación (lisis alcalina)
Inocular una única colonia bacteriana en 3 a 5 ml de medio LB con el antibiótico adecuado e incubar a 37 °C con agitación a 220 rpm durante 12 a 16 horas. Coseche las células centrifugando 1,5–2 ml de cultivo a 8000 × g durante 2 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 250 l de tampón de resuspensión (P1, que contiene Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM y RNasa A de 100 g/ml). Agregue 250 µl de tampón de lisis (P2, NaOH 200 mM, SDS al 1%), mezcle suavemente invirtiendo de 4 a 6 veces e incube a temperatura ambiente durante 3 minutos; no agite ni exceda los 5 minutos. Añadir 350 ml de tampón de neutralización (P3, acetato de potasio 3 M, pH 5,5), mezclar inmediatamente invirtiendo e incubar en hielo durante 5 minutos. Centrifugar a 13.000 × g durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante transparente a una columna de membrana de sílice. Centrifugar a 13.000 × g durante 1 minuto, desechar el flujo continuo. Lavar con 750 l de tampón de lavado (que contiene etanol) y centrifugar durante 1 minuto. Repetir con un segundo lavado. Secar la columna centrifugando durante 2 minutos. Eluya el ADN en 30–50 ml de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5) o agua libre de nucleasas centrifugando durante 1 minuto después de una incubación de 2 minutos. Evalúe el rendimiento mediante espectrofotometría UV: un cultivo típico de 5 ml produce entre 5 y 15 g de ADN plásmido con A260/A280 > 1,8 y A260/A230 > 2,0. Para plásmidos de baja copia, aumente el volumen de cultivo a 10 ml o utilice un kit de purificación específico de baja copia.
Aplicación del mundo real
Después de clonar un inserto de 1,5 kb en pET-28a, se cultivan 6 colonias positivas para la minipreparación. Las lecturas de A260 muestran rendimientos de 8 a 12 µg por preparación. La digestión de restricción con NcoI y XhoI confirma el inserto en las 6 muestras. Los plásmidos purificados se envían para la secuenciación de Sanger, lo que arroja cromatogramas de alta calidad sin ruido de fondo.
