La PCR cuantitativa (qPCR), también conocida como PCR en tiempo real, es una técnica de laboratorio que amplifica y cuantifica simultáneamente el ADN en tiempo real. A diferencia de la PCR convencional, que solo muestra la cantidad final de ADN, la qPCR monitorea la acumulación de ADN durante toda la reacción mediante fluorescencia.
Cómo funciona la qPCR
- Configuración de la reacción
La reacción contiene los mismos componentes que la PCR convencional (ADN molde, cebadores, ADN polimerasa y nucleótidos) además de un indicador fluorescente. Dos sistemas indicadores comunes son SYBR Green, un tinte que emite fluorescencia cuando se une a ADN bicatenario, y las sondas TaqMan, que son sondas fluorescentes de secuencia específica.
- Amplificación y Detección
La reacción sufre el mismo ciclo térmico que la PCR estándar: desnaturalización, hibridación y extensión. Después de cada ciclo, se toma una medición de fluorescencia. A medida que se amplifica más ADN, la señal de fluorescencia aumenta proporcionalmente.
- El valor Ct
El ciclo umbral (Ct) es el número de ciclo en el que la señal de fluorescencia se eleva por encima del nivel de fondo. El valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad inicial de ADN objetivo: más ADN inicial significa que se necesitan menos ciclos para alcanzar el umbral.
- Cuantificación
La cuantificación absoluta utiliza una curva estándar de concentraciones de ADN conocidas para calcular la cantidad exacta de ADN objetivo. La cuantificación relativa compara los valores de Ct de un gen diana con un gen de referencia, determinando los cambios en la expresión.
- Análisis de la curva de fusión
Cuando se utiliza SYBR Green, se realiza un análisis de la curva de fusión después de la amplificación. El ADN se calienta lentamente mientras se controla la fluorescencia. Cada producto de ADN se funde a una temperatura característica, lo que confirma que se produjo el amplicón correcto y que no hay dímeros de cebador presentes.
Protocolo práctico de qPCR
Prepare la reacción en una placa de 96 o 384 pocillos. Para SYBR Green, mezcle 5 l de mezcla maestra 2× SYBR Green, 0,5 l de cada cebador (10 m), 2 l de ADNc o ADN de plantilla y agua hasta 10 l. Para la detección basada en sonda, reemplace SYBR Green con una mezcla maestra de sonda 2× y agregue 0,2–0,4 µM de cada sonda. Sellar la placa con película adhesiva óptica y centrifugar brevemente. Ejecute en un ciclador en tiempo real con el siguiente programa: 95 °C durante 2 minutos (activación de la polimerasa), luego 40 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 30 a 60 segundos (recocido y extensión). Recopile datos de fluorescencia al final de cada paso de extensión. Después del ciclo, realice una rampa de curva de fusión de 60 °C a 95 °C si usa SYBR Green. Para una cuantificación absoluta, prepare una curva estándar diluyendo en serie una plantilla conocida (10^7 a 10^2 copias/μL en pasos de 10 veces). Trace Ct frente al número de copias del registro y verifique que la pendiente esté entre −3,1 y −3,6 (90–110% de eficiencia). Para la cuantificación relativa utilizando el método ΔΔCq, calcule ΔCt = Ct(objetivo) − Ct(referencia), luego ΔΔCt = ΔCt(tratado) − ΔCt(control). Cambio de pliegue = 2^(−ΔΔCt). Incluya controles sin plantilla y controles sin RT para objetivos basados en ARN. Procese todas las muestras por triplicado técnico y descarte las que tengan una desviación estándar de Ct > 0,5.
Aplicación del mundo real
En estudios de expresión genética para la investigación del cáncer, la RT-qPCR con SYBR Green cuantifica los niveles de ARNm de oncogenes como MYC y supresores de tumores como TP53. GAPDH o ACTB sirven como gen de referencia. El ARN del tumor y del tejido normal adyacente se transcribe de forma inversa, y el análisis de ΔΔCq revela que MYC está regulado positivamente 8,5 veces en los tumores (p <0,001). El análisis de la curva de fusión confirma un único producto a la Tm esperada, descartando artefactos del dímero del cebador.
