La secuenciación de ARN (RNA-Seq) es una técnica que utiliza la secuenciación de próxima generación para analizar el conjunto completo de transcritos de ARN en una muestra de células o tejido. Proporciona una instantánea de la expresión génica, revelando qué genes están activos y en qué niveles.
Cómo funciona el RNA-Seq
- Extracción de ARN
El ARN total se extrae de la muestra utilizando métodos similares al aislamiento de ADN, pero con pasos adicionales para preservar las frágiles moléculas de ARN. La integridad del ARN se verifica mediante electroforesis en gel o un bioanalizador.
- Enriquecimiento de ARNm o agotamiento de ARNr
Dado que el ARN ribosomal constituye la mayor parte del ARN total, se elimina para enriquecer el ARN mensajero (ARNm). Esto se hace utilizando perlas de poli-T que capturan las colas de poli-A del ARNm, o agotando selectivamente las secuencias de ARN ribosomal.
- Preparación de la librería
El ARNm enriquecido se fragmenta en piezas pequeñas y se transcribe inversamente a ADN complementario (ADNc) utilizando cebadores aleatorios. Los adaptadores se ligan a los fragmentos de ADNc y la librería se amplifica mediante PCR.
- Secuenciación
La librería de ADNc se secuencia en una plataforma NGS, generando millones de lecturas cortas. Cada lectura representa una secuencia corta de un extremo de un fragmento de ADNc.
- Análisis de datos
Las lecturas se alinean con un genoma o transcriptoma de referencia. El número de lecturas que se mapean a cada gen se cuenta para cuantificar los niveles de expresión. El análisis de expresión diferencial identifica genes que están significativamente regulados al alza o a la baja entre condiciones.
- Aplicaciones
El RNA-Seq se utiliza para estudiar cambios en la expresión génica durante el desarrollo, enfermedades, tratamientos farmacológicos y respuestas ambientales. También puede detectar splicing alternativo, transcritos novedosos y ARN no codificante.
