La secuenciación de ARN (RNA-Seq) es una técnica que utiliza secuenciación de próxima generación para analizar el conjunto completo de transcripciones de ARN en una muestra de célula o tejido. Proporciona una instantánea de la expresión genética, revelando qué genes están activos y en qué niveles.
Cómo funciona RNA-Seq
- Extracción de ARN
El ARN total se extrae de la muestra mediante métodos similares al aislamiento del ADN, pero con pasos adicionales para preservar las frágiles moléculas de ARN. La integridad del ARN se comprueba mediante electroforesis en gel o un bioanalizador.
- Enriquecimiento de ARNm o agotamiento de ARNr
Dado que el ARN ribosómico constituye la mayor parte del ARN total, se elimina para enriquecerlo en ARN mensajero (ARNm). Esto se hace utilizando perlas poli-T que capturan las colas poli-A del ARNm o agotando selectivamente las secuencias de ARN ribosómico.
- Preparación de la biblioteca
El ARNm enriquecido se fragmenta en pequeños trozos y se transcribe de forma inversa en ADN complementario (ADNc) utilizando cebadores aleatorios. Los adaptadores se ligan a los fragmentos de ADNc y la biblioteca se amplifica mediante PCR.
- Secuenciación
La biblioteca de ADNc se secuencia en una plataforma NGS, lo que genera millones de lecturas breves. Cada lectura representa una secuencia corta de un extremo de un fragmento de ADNc.
- Análisis de datos
Las lecturas están alineadas con un genoma o transcriptoma de referencia. El número de lecturas que se asignan a cada gen se cuenta para cuantificar los niveles de expresión. El análisis de expresión diferencial identifica genes que están significativamente regulados hacia arriba o hacia abajo entre condiciones.
- Aplicaciones
RNA-Seq se utiliza para estudiar cambios en la expresión genética en el desarrollo, enfermedades, tratamientos farmacológicos y respuestas ambientales. También puede detectar empalmes alternativos, transcripciones novedosas y ARN no codificantes.
Protocolo práctico RNA-Seq
Extraiga el ARN total utilizando TRIzol o un método basado en columnas con tratamiento con ADNasa en columna. Evalúe la integridad del ARN en un bioanalizador o TapeStation: se requiere un número de integridad de ARN (RIN) > 7 para mRNA-Seq, mientras que > 5 puede ser suficiente para RNA-Seq total con agotamiento de rRNA. Para el enriquecimiento de ARNm, incube 0,1–1 µg de ARN total con perlas magnéticas unidas a oligopoli-T para capturar ARNm poliadenilado. Como alternativa, utilice un kit Ribo-Zero para agotar el ARNr citoplasmático y mitocondrial. Fragmentar el ARNm enriquecido mediante incubación a 94 °C durante 8 minutos en tampón de fragmentación, generando fragmentos de ~200 nt. Sintetizar ADNc de primera cadena utilizando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa a 25°C durante 10 minutos, 42°C durante 50 minutos y 70°C durante 15 minutos. Reemplace la cadena de ARN con dUTP durante la síntesis de la segunda cadena para permitir la especificidad de la cadena; la segunda cadena que contiene dUTP se degradará selectivamente durante la amplificación de la biblioteca. Realice la reparación de extremos, la unión en A y la ligadura del adaptador como en la preparación de la biblioteca NGS estándar. Degradar la segunda hebra marcada con dUTP utilizando la enzima USUARIO antes del enriquecimiento por PCR (10 a 15 ciclos). Secuenciar la biblioteca final en una plataforma Illumina generando entre 20 y 40 millones de lecturas de pares por muestra (2 × 75 pb o 2 × 150 pb). Procese archivos FASTQ sin procesar a través de un canal bioinformático: ajuste de calidad con cutadapt, alinee con el genoma de referencia usando STAR (modo de 2 pasos para uniones de empalme novedosas), cuantifique recuentos a nivel de genes con featureCounts o HTSeq e identifique genes expresados diferencialmente con DESeq2 o edgeR usando un umbral de tasa de descubrimiento falso de 0,05. Incluya al menos tres réplicas biológicas por condición para obtener poder estadístico.
Aplicación del mundo real
En un estudio que compara los hepatocitos tratados con fármacos con los de control, RNA-Seq identifica 1247 genes expresados diferencialmente (FDR <0,05). El análisis de enriquecimiento de vías revela una regulación positiva de los genes del metabolismo de los lípidos y una regulación negativa de las vías inflamatorias. Los datos se validan mediante RT-qPCR en 10 genes seleccionados, lo que confirma la dirección y la magnitud de los cambios.
