Descripción general
La proteómica dirigida se centra en cuantificar un conjunto predefinido de proteínas con alta sensibilidad, especificidad y rendimiento, en contraste con la proteómica de descubrimiento que apunta a una cobertura amplia y no dirigida. La técnica más adoptada es la monitorización de reacciones seleccionadas (SRM, también llamada monitorización de reacciones múltiples o MRM) realizada en espectrómetros de masas de triple cuadrupolo. Los ensayos SRM se dirigen a transiciones específicas de péptido-precursor a fragmento, conocidas como péptidos proteotípicos, que representan de forma única la proteína de interés. Este enfoque ofrece una precisión cuantitativa comparable a los inmunoensayos y al mismo tiempo ofrece una mayor capacidad de multiplexación y un desarrollo de ensayos más rápido.
Métodos
El desarrollo del ensayo comienza con la selección de péptidos proteotípicos: péptidos que son exclusivos de la proteína objetivo, vuelan bien en el espectrómetro de masas y producen iones fragmentados intensos. Para cada péptido, se monitorean varias transiciones (ión precursor m/z a ion fragmento m/z) a lo largo del período de elución cromatográfica. Los estándares internos, normalmente versiones marcadas con isótopos estables de los péptidos diana, se añaden a la muestra en concentraciones conocidas para permitir una cuantificación absoluta. El monitoreo de reacciones paralelas (PRM) en los instrumentos Orbitrap ofrece un enfoque relacionado con la adquisición de espectro completo de alta resolución. Los métodos de adquisición independiente de datos (DIA), como SWATH-MS, cierran la brecha entre el descubrimiento y el análisis dirigido al registrar todos los fragmentos de iones de todos los precursores de forma sistemática.
Protocolo práctico
El desarrollo de un ensayo SRM/MRM comienza con la identificación de péptidos proteotípicos para la proteína objetivo. Utilizando bibliotecas espectrales de PeptideAtlas o SRMAtlas, el investigador selecciona péptidos que tienen entre 7 y 25 aminoácidos de largo, carecen de sitios de escisión perdidos, evitan la metionina y el triptófano (que son propensos a la oxidación) y producen intensos fragmentos de iones y o b a partir de datos de espectrometría de masas. Para cada péptido, se seleccionan de 3 a 5 transiciones: los 3 a 5 iones fragmentados más intensos del espectro de la biblioteca. Se sintetiza un péptido estándar marcado con isótopos pesados para cada objetivo, incorporando arginina o lisina marcada con 13C/15N para producir un desplazamiento de masa de 6-10 Da. El estándar pesado se añade a cada muestra a una concentración conocida antes de la digestión o después de la digestión, según la estrategia de cuantificación. El espectrómetro de masas de triple cuadrupolo está configurado con Q1 y Q3 transmitiendo los valores m/z del precursor y del fragmento, respectivamente, mientras que Q2 realiza la fragmentación inducida por colisión con energías de colisión optimizadas específicas para cada transición. El SRM programado monitorea cada transición dentro de un período de tiempo de retención de 2 a 3 minutos, maximizando la cantidad de péptidos cuantificados por ejecución. Los datos sin procesar se procesan en Skyline: se integran los picos cromatográficos, se confirman los tiempos de retención frente al estándar interno pesado y se calcula la relación del área del pico ligero a pesado. La concentración absoluta se deriva de esta relación y de la concentración estándar conocida. Un ejemplo del mundo real: se desarrolló un ensayo MRM multiplexado que cuantifica 50 proteínas asociadas al cáncer en plasma para la detección temprana del cáncer de pulmón de células no pequeñas, logrando límites de detección por debajo de 1 ng/ml para 35 de los 50 objetivos. El ensayo se validó en 500 muestras de pacientes con coeficientes de variación inferiores al 15 %.
Aplicaciones
La proteómica dirigida es el método de elección para verificar y validar biomarcadores candidatos descubiertos en estudios no dirigidos. Se utiliza ampliamente en la investigación clínica para cuantificar paneles de proteínas relacionadas con enfermedades específicas. Los ensayos complementan las mediciones tradicionales de ELISA, ofrecen una alternativa a los enfoques basados en gel y la electroforesis en gel capilar y se pueden multiplexar para rastrear docenas de proteínas en una sola ejecución. La integración con la separación HPLC y la detección espectrometría de masas garantiza una cuantificación sólida, mientras que los ensayos de cuantificación de proteínas proporcionan una validación ortogonal de la concentración de proteína total.
