A eletroforese em gel de agarose é uma técnica laboratorial fundamental usada para separar fragmentos de DNA com base em seu tamanho. Quando os cientistas precisam analisar o DNA após a digestão de restrição, PCR ou purificação, eles recorrem à eletroforese em gel para visualizar os resultados. Embora os géis de agarose em placas continuem sendo o padrão para análise de DNA de rotina, [eletroforese em gel capilar](/guides/eletroforese em gel capilar) (CGE) oferece uma alternativa automatizada e de alto rendimento com detecção de fluorescência induzida por laser, amplamente utilizada em perfis forenses de DNA e sequenciamento de DNA.

Como funciona a eletroforese em gel de agarose

A técnica baseia-se no fato de que o DNA tem carga negativa e migrará em direção a um eletrodo positivo quando colocado em um campo elétrico.

1. Preparando o Gel

O pó de agarose é misturado com tampão TAE ou TBE (normalmente 1× TAE ou 0,5× TBE) e aquecido até dissolver. A agarose derretida é colocada em uma bandeja de fundição com um pente inserido para criar poços. À medida que esfria, solidifica em uma matriz de gel porosa.

2. Carregando as Amostras

As amostras de DNA são misturadas com um corante contendo glicerol (para fazê-las afundar) e corantes de rastreamento (para monitorar a migração). As amostras são pipetadas nos poços do gel. Uma escada de DNA – uma mistura de fragmentos com tamanhos conhecidos – é carregada no primeiro poço como referência de tamanho.

3. Eletroforese

Uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA tem carga negativa, os fragmentos se movem através do gel em direção ao eletrodo positivo. Fragmentos menores navegam facilmente pelos poros do gel e viajam rapidamente, enquanto fragmentos maiores se movem mais lentamente. Com o tempo, os fragmentos se separam em bandas distintas com base no seu tamanho.

4. Visualização

Após a eletroforese, o gel é corado com um corante de ligação ao DNA, como brometo de etídio ou SYBR Safe. Quando colocado sob luz UV, o corante fica fluorescente, revelando as bandas de DNA. Ao comparar as posições das bandas com a escada do DNA, os cientistas podem determinar o tamanho de cada fragmento.

Protocolo Prático de Eletroforese em Gel

Selecione a porcentagem de agarose com base nos tamanhos de fragmentos esperados: 0,7% para 0,8–10 kb, 1,0% para 0,5–5 kb, 1,5% para 0,2–3 kb e 2,0% para 0,1–1 kb. Pese a quantidade apropriada de agarose (por exemplo, 1 g para um gel de 1%) e adicione 100 mL de tampão TAE 1×. Aqueça no microondas até que a agarose se dissolva completamente – agite a cada 30 segundos para evitar o superaquecimento. Resfrie a ~60°C, adicione 5 μL de GelGreen ou brometo de etídio (10 mg/mL), misture e despeje em uma bandeja de fundição com o pente inserido. Deixe solidificar por 20–30 minutos. Coloque o gel no tanque de eletroforese preenchido com 1× TAE. Misture 5 μL de cada amostra de DNA com 1 μL de corante de carga 6× (contendo glicerol e azul de bromofenol). Carregue todo o volume em um poço. Carregue 5 μL de uma escada Plus DNA de 1 kb no primeiro e último poços. Execute a 5–10 V/cm (medida como a distância entre os eletrodos), para um gel de 10 cm, 80–100 V é típico. Execute até que a frente do corante azul de bromofenol tenha migrado aproximadamente dois terços do comprimento do gel (30 a 60 minutos). Visualize em um transiluminador UV (302 nm para brometo de etídio, 470 nm para GelGreen) e fotografe. Para aplicações a jusante (extração de gel), use um UV de comprimento de onda longo (365 nm) para minimizar danos ao DNA.

Aplicação no mundo real

Após amplificação por PCR de um fragmento genético de 1,5 kb, 5 µL de produto são executados em um gel de agarose a 1% ao lado de uma escada de 1 kb. Uma banda única brilhante de 1,5 kb confirma a amplificação bem-sucedida sem dímero de primer ou produtos inespecíficos. O gel é fotografado e a banda é excisada sob UV para purificação e clonagem.