A Co-Imunoprecipitação (Co-IP) é o método mais amplamente utilizado para detetar e identificar interações proteína–proteína em condições nativas. Usa um anticorpo específico para capturar uma proteína isco e quaisquer proteínas ligadas a ela a partir de um lisado celular.

Princípio

Um anticorpo contra a proteína alvo (isco) é imobilizado num suporte sólido — tipicamente contas de agarose Proteína A/G ou contas magnéticas. Quando as contas conjugadas com anticorpo são incubadas com um lisado celular ou tecidual, a proteína isco é capturada juntamente com quaisquer proteínas que estejam fisicamente associadas a ela. Após lavagem para remover o material não ligado, as proteínas ligadas são eluídas e analisadas por Western blot ou espectrometria de massa.

Visão Geral do Protocolo

1. Prepare o lisado usando um tampão de lise suave e não desnaturante que preserve as interações proteicas (ex.: Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 1%, inibidores de protease). Mantenha as amostras em gelo.
2. Pré-clarifique o lisado incubando com contas vazias (sem anticorpo) para remover proteínas que se ligam inespecificamente à superfície das contas.
3. Incube o lisado pré-clarificado com as contas conjugadas com anticorpo a 4 °C durante 1–4 horas (ou durante a noite) com rotação suave.
4. Lave as contas 3–5 vezes com tampão de lise frio. A severidade pode ser aumentada elevando a concentração de sal (NaCl 250–500 mM) ou adicionando um detergente suave (Tween-20 0,1%).
5. Elua as proteínas ligadas com tampão de amostra SDS-PAGE e calor (5 minutos a 95 °C).
6. Analise por Western blot (para interatores conhecidos) ou espectrometria de massa (para descoberta).

Controlos

Controlos rigorosos são essenciais:

• Controlo de isotipo: use um anticorpo inespecífico do mesmo isotipo para distinguir a ligação específica do fundo.
• Controlo apenas de contas: contas sem anticorpo para identificar proteínas que se ligam à matriz das contas.
• Controlo de knockdown/knockout: lisado de células que não possuem a proteína isco demonstra a especificidade do anticorpo.
• Co-IP reversa: realize a IP recíproca usando um anticorpo contra o suposto interator.

Reticulação

Os próprios anticorpos co-eluem com o alvo e podem interferir com a espectrometria de massa. A reticulação do anticorpo às contas (usando DSS ou BS³) antes da incubação impede a eluição do anticorpo. Um controlo com contas reticuladas deve confirmar que o anticorpo ainda é funcional após a reticulação.

Variantes

• Co-IP nativa: usa tampão de lise não desnaturante. Preserva complexos nativos, mas pode coprecipitar proteínas indiretamente associadas.
• Co-IP com reticulação: um reticulador reversível (ex.: formaldeído, DSP) estabiliza interações fracas ou transitórias antes da lise.
• Co-IP nuclear: para complexos de fatores de transcrição, use um protocolo de extração nuclear e inclua DNase I para libertar proteínas ligadas à cromatina.