A reação em cadeia da polimerase (PCR) gerou inúmeras variantes e aplicações especializadas que estendem sua utilidade além da simples amplificação de DNA. Essas técnicas permitem detecção de mutações, análise de metilação, diagnósticos moleculares e identificação forense.

PCR Alelo-Específica

A PCR alelo-específica discrimina entre sequências de DNA que diferem por um único nucleotídeo. O método usa iniciadores com a base terminal 3-prima posicionada no sítio polimórfico. Quando a base terminal corresponde ao molde, a amplificação prossegue eficientemente. Quando há incompatibilidade, a extensão é bloqueada ou grandemente reduzida. Usando dois iniciadores específicos para cada alelo em reações separadas, o genótipo pode ser determinado. A técnica é amplamente usada para genotipagem de polimorfismos de nucleotídeo único e detecção de mutações associadas a doenças como fator V Leiden e protrombina G20210A.

PCR Específica para Metilação

A PCR específica para metilação detecta padrões de metilação do DNA, que são marcas epigenéticas importantes no câncer e desenvolvimento. O DNA genômico é tratado com bissulfito de sódio, que converte citosinas não metiladas em uracila, deixando as citosinas metiladas inalteradas. A PCR com iniciadores desenhados para distinguir as sequências convertidas e não convertidas determina então o estado de metilação dos sítios CpG. A técnica é usada para detectar metilação aberrante de promotores em genes supressores tumorais e para análise de imprinting.

PCR Inversa

A PCR inversa amplifica regiões de DNA flanqueando uma sequência conhecida, útil para identificar sítios de inserção ou caracterizar regiões flanqueadoras desconhecidas. O DNA genômico é digerido com uma enzima de restrição que corta fora da região conhecida, e os fragmentos são circularizados por ligação. A PCR com iniciadores orientados para fora a partir da sequência conhecida amplifica então o DNA flanqueador desconhecido através da junção de ligação. A PCR inversa tem sido usada para caracterizar sítios de inserção de transposons e sítios de integração viral no genoma.

PCR Degenerada

A PCR degenerada usa pools de iniciadores contendo bases mistas em posições específicas para amplificar genes relacionados de diferentes espécies ou membros de uma família gênica. Os iniciadores são desenhados a partir de sequências conservadas de aminoácidos, com degeneração introduzida nas posições de oscilação dos códons. A técnica é usada para clonar genes homólogos de novas espécies, identificar membros de famílias gênicas e detectar patógenos com sequências variáveis. A PCR touchdown, onde a temperatura de anelamento é progressivamente diminuída, melhora a especificidade na PCR degenerada.

Aplicações da PCR Quantitativa

A PCR quantitativa (qPCR) estende-se além da medição de expressão gênica. A análise de variação do número de cópias usa qPCR para detectar deleções ou amplificações gênicas comparando a amplificação de um gene alvo com um gene de referência. A técnica é usada no teste de HER2 para câncer de mama e para detectar anormalidades cromossômicas. A detecção de patógenos usa qPCR para quantificar carga viral em pacientes com HIV, hepatite B e hepatite C, orientando decisões de tratamento. A detecção de OGM quantifica a quantidade de material geneticamente modificado em produtos alimentícios.

Aplicações da PCR Digital

A PCR digital fornece quantificação absoluta sem curvas padrão. É usada para detectar mutações raras em DNA tumoral circulante, permitindo biópsia líquida para monitoramento do câncer. A PCR digital também detecta doença residual após tratamento, identifica aneuploidias fetais a partir de sangue materno e caracteriza variações no número de cópias com alta precisão. A alta sensibilidade da PCR digital permite detecção de alelos mutantes presentes em frequências abaixo de 0,1%.

PCR Forense

A análise de repetições curtas em tandem usando PCR multiplex é o método padrão para identificação humana em forense. Kits comerciais amplificam 15 a 20 loci STR mais o marcador de determinação sexual amelogenina em uma única reação. Os fragmentos amplificados são separados por eletroforese capilar, e os tamanhos dos alelos são determinados. A probabilidade de dois indivíduos não aparentados compartilharem o mesmo perfil STR é tipicamente menor que uma em um bilhão. A análise de DNA de toque permite perfilagem a partir de amostras mínimas contendo apenas algumas células.

PCR de Célula Única

A PCR de célula única amplifica o genoma ou transcriptoma de células individuais, revelando heterogeneidade que é mascarada na análise em massa. A técnica começa com isolamento celular por micromanipulação, separação por fluxo ou microfluídica. A amplificação do genoma inteiro usando amplificação por deslocamento múltiplo ou métodos baseados em PCR aumenta a quantidade de DNA para análise downstream. O sequenciamento de RNA de célula única usa transcrição reversa e amplificação por PCR para perfil de expressão gênica em células individuais, revelando tipos celulares, estados e trajetórias de desenvolvimento.