In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine Technik, die markierte Nukleinsäuresonden verwendet, um spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen direkt in Gewebeschnitten oder zytologischen Präparaten nachzuweisen. Im Gegensatz zu extraktionsbasierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung) bewahrt ISH die Gewebearchitektur und zeigt genau, welche Zellen die Zielsequenz enthalten.
Prinzipien
ISH verwendet eine Sonde – ein einzelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül, das zur Zielsequenz komplementär ist. Die Sonde ist mit einem nachweisbaren Marker (radioaktives Isotop, Fluorophor, Hapten) markiert. Nach Denaturierung der Ziel-DNA (für DNA-ISH) oder ohne Denaturierung (für RNA-ISH) hybridisiert die Sonde unter kontrollierten Temperatur- und Salzbedingungen mit der Zielsequenz. Ungebundene Sonde wird abgewaschen und die gebundene Sonde wird durch Autoradiographie, Fluoreszenzmikroskopie oder enzymbasierte chromogene Detektion nachgewiesen.
Stringenz – die Spezifität der Hybridisierung wird durch Temperatur und Salzkonzentration gesteuert. Hohe Stringenz (hohe Temperatur, geringer Salzgehalt) ermöglicht die Bildung nur perfekt aufeinander abgestimmter Sonden-Ziel-Hybride. Eine geringere Stringenz ermöglicht teilweise Fehlpaarungen, was für die Erkennung verwandter Sequenzen wünschenswert sein kann, aber den Hintergrund erhöht.
Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)
FISH verwendet Fluorophor-markierte Sonden, die durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Es ist die am weitesten verbreitete ISH-Methode in der diagnostischen Pathologie. Zu den FISH-Sonden gehören: Zentromer-Zählungssonden (CEP) – zielen auf chromosomenspezifische Alpha-Satelliten-DNA in Zentromeren ab und werden zum Nachweis von Aneuploidie verwendet; Locus-spezifische Indikatorsonden (LSI) – zielen auf einzigartige Sequenzen an bestimmten chromosomalen Loci ab und werden zum Nachweis von Genamplifikation (HER2, EGFR) und Deletion (1p/19q bei Oligodendrogliomen) verwendet; Auseinanderbrechende Sonden – Sondenpaare, die einen Genort flankieren; Trennung zeigt Translokation an (ALK, ROS1, MYC, BCL2, BCL6, MALT1); Fusionssonden – eine Sonde auf jeder Seite eines Translokationsbruchpunkts; Fusionssignale zeigen die Translokation an.
HER2 FISH – der Goldstandard für die Bestimmung des HER2-Status bei Brust- und Magenkrebs. Ein Verhältnis von HER2 (17q12)-Signalen zu CEP17-Signalen >2,0 wird verstärkt. FISH wird durchgeführt, wenn die IHC nicht eindeutig ist (Score 2+).
ALK FISH – Break-Apart-FISH für ALK (2p23)-Umlagerung beim Lungenadenokarzinom erkennt Patienten, die auf ALK-Inhibitoren (Crizotinib, Alectinib) ansprechen. ALK IHC (D5F3-Klon) hat FISH als primären Screening-Test weitgehend ersetzt, FISH bleibt jedoch die Bestätigungsmethode.
Chromogene In-Situ-Hybridisierung (CISH)
CISH verwendet Hapten-markierte Sonden, die durch eine enzymbasierte chromogene Reaktion nachgewiesen werden (DAB für Braun, Fast Red für Rot). Das Signal ist unter einem Hellfeldmikroskop sichtbar und ermöglicht die gleichzeitige Auswertung von Morphologie und Hybridisierungssignal. CISH ist kostengünstiger als FISH (kein Fluoreszenzmikroskop erforderlich), produziert permanente Objektträger und ist in routinemäßigen histopathologischen Labors besser zugänglich.
RNA-In-Situ-Hybridisierung
RNA ISH erkennt spezifische mRNA-Transkripte in Gewebeschnitten. RNAscope (Advanced Cell Diagnostics) ist eine kommerziell erhältliche RNA-ISH-Technologie, die eine Sondendesignstrategie (doppelte Z-Sonden) verwendet, die den Hintergrund unspezifischer Sondenbindung eliminiert. Jede Ziel-mRNA erscheint als punktförmiges Signal im Zytoplasma (oder im Zellkern für entstehende Transkripte). RNAscope ist bis zu 100-mal empfindlicher als herkömmliche RNA-ISH und kann nur 1–2 mRNA-Kopien pro Zelle erkennen.
Zu den Anwendungen von RNA ISH gehören: Nachweis viraler RNA (EBV EBER – die Standardmethode zur Identifizierung EBV-infizierter Zellen bei Hodgkin-Lymphom, lymphoproliferativen Erkrankungen nach Transplantation, Nasopharynxkarzinom); HPV-RNA (E6/E7-mRNA-Nachweis bestätigt eine transkriptionell aktive HPV-Infektion); Genexpressionsanalyse (PD-L1-mRNA, Zytokinexpression in entzündlichen Infiltraten); Abstammungsbestimmung (Nachweis gewebespezifischer Transkripte in schlecht differenzierten Tumoren).
Diagnoseanwendungen
Lymphomdiagnose – FISH auf MYC-, BCL2- und BCL6-Translokationen bei diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen (Double-Hit- und Triple-Hit-Lymphome). EBER ISH für EBV bei Hodgkin-Lymphom und lymphoproliferativer Störung nach Transplantation.
Sarkomdiagnose – FISH für SS18 (Synovialsarkom), FKHR (alveoläres Rhabdomyosarkom), EWSR1 (Ewing-Sarkom, desmoplastischer kleiner rundzelliger Tumor) und MDM2 (gut differenziertes/dedifferenziertes Liposarkom).
Lungenkrebs – ALK FISH, ROS1 FISH und MET-Amplifikations-FISH für die gezielte Therapieauswahl.
Brustkrebs – HER2-FISH für zweifelhafte IHC-Fälle.
Einschränkungen
FISH erfordert Fluoreszenzmikroskopie und spezielle Software zur Signalzählung. Die Sondenpenetration in dicken Gewebeschnitten kann unvollständig sein. Signalschwund – Photobleichung der Fluorophore bei längerer Anregung; Objektträger sollten im Dunkeln aufbewahrt werden. Zu den Herausforderungen bei der Interpretation gehören geschnittene Kerne (Verkürzungsartefakte in Paraffinschnitten können Signale löschen – verwenden Sie 4-µm-Schnitte), überlappende Signale und Polysomie. RNA-Abbau in schlecht konserviertem Gewebe führt zu falsch-negativem RNA-ISH. Qualitätssicherung umfasst die regelmäßige Validierung mit bekannten Positiv- und Negativkontrollen, die Teilnahme an EQA-Programmen und dokumentierte Interpretationskriterien.
