Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) ist eine Technik zum Nachweis und zur Amplifikation von RNA. Es kombiniert zwei Schritte: Reverse Transkription von RNA in komplementäre DNA (cDNA), gefolgt von der PCR-Amplifikation der cDNA. Dadurch können Wissenschaftler die Genexpression untersuchen und RNA-Viren nachweisen.
Wie RT-PCR funktioniert
- RNA-Extraktion
Die Gesamt-RNA wird aus der Probe extrahiert und mit DNase behandelt, um kontaminierende genomische DNA zu entfernen. Die RNA-Qualität und -Konzentration werden vor dem Fortfahren überprüft.
- Reverse Transkription
Die RNA wird mit dem Enzym Reverse Transkriptase, Zufallsprimern oder Oligo-dT-Primern und Nukleotiden gemischt. Die Reverse Transkriptase nutzt die RNA als Matrize, um einen komplementären DNA-Strang zu synthetisieren. Die RNA-Matrize wird dann durch RNase H abgebaut, wodurch einzelsträngige cDNA zurückbleibt.
- PCR-Amplifikation
Die cDNA wird dann als Vorlage für die Standard-PCR mit genspezifischen Primern verwendet. Die PCR amplifiziert die cDNA und produziert genügend DNA, um sie auf einem Gel sichtbar zu machen oder durch qPCR zu quantifizieren.
- Erkennung
Die amplifizierten PCR-Produkte werden mittels [Agarose-Gelelektrophorese] analysiert (/de/guides/agarose-gel-electrophoresis.html). Das Vorhandensein einer Bande in der erwarteten Größe bestätigt, dass die Ziel-RNA in der Originalprobe vorhanden war.
- Bewerbungen RT-PCR wird häufig verwendet, um Genexpressionsniveaus zu messen, RNA-Viren wie HIV und SARS-CoV-2 zu erkennen, RNA-Sequenzierungs-Daten zu validieren und alternatives Spleißen zu analysieren. In Kombination mit qPCR wird daraus RT-qPCR, was eine Echtzeitquantifizierung von RNA ermöglicht.
Praktisches RT-PCR-Protokoll
Beginnen Sie mit der Extraktion der gesamten RNA mithilfe einer Silica-Säule oder einer TRIzol-basierten Methode. Bewerten Sie die RNA-Integrität durch Agarosegelelektrophorese oder einen Bioanalysator – intakte RNA zeigt scharfe ribosomale 28S- und 18S-Banden mit einem 28S:18S-Verhältnis nahe 2:1. Messen Sie Konzentration und Reinheit durch UV-Spektrophotometrie (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Behandeln Sie 1–5 µg RNA mit DNase I 30 Minuten lang bei 37 °C und inaktivieren Sie sie anschließend 10 Minuten lang bei 75 °C hitzeinaktivieren. Für die Reverse Transkription mischen Sie die DNase-behandelte RNA mit zufälligen Hexameren oder Oligo-dT-Primern (50–250 ng), 1 mM dNTPs und 200 U Reverse Transkriptase im mitgelieferten Puffer. 10 Minuten bei 25 °C, 50 Minuten bei 42 °C und 15 Minuten bei 70 °C inkubieren. Verdünnen Sie die resultierende cDNA vor der PCR-Amplifikation 5–10-fach. Fügen Sie immer eine Kontrolle ohne Reverse Transkriptase (keine RT) hinzu, um eine genomische DNA-Kontamination zu erkennen. Wenn die Probe ohne RT ein PCR-Produkt produziert, ist restliche DNA vorhanden. Entwerfen Sie genspezifische Primer so, dass sie eine Exon-Exon-Verbindung überspannen, um eine Amplifikation genomischer DNA zu vermeiden. Ein Vorwärtsprimer auf einem Exon und ein Rückwärtsprimer auf einem stromabwärts gelegenen Exon stellen sicher, dass nur gespleißte cDNA amplifiziert wird.
Reale Anwendung
Bei der SARS-CoV-2-Diagnostik zielt die RT-PCR mithilfe von CDC- oder WHO-Primer-Sonden-Sets auf die viralen N-, E- und RdRp-Gene ab. RNA wird aus Nasopharynxabstrichen extrahiert und RT-qPCR mit doppelt markierten Sonden erkennt virale RNA bei Zyklusschwellenwerten (Ct) unter 40. Ein positives Ergebnis bei zwei von drei Genzielen bestätigt eine Infektion. Die Einbeziehung einer internen Kontrolle (z. B. menschliche RNase P) überprüft die Eignung der Probe und den Extraktionserfolg und verhindert so falsch negative Ergebnisse aufgrund einer schlechten Probenentnahme.
