A PCR digital (dPCR) é um refinamento da PCR convencional que fornece quantificação absoluta de ácidos nucleicos sem a necessidade de uma curva padrão. A amostra é dividida em milhares de pequenas reações individuais e, após a amplificação, o número de partições positivas versus negativas é contado.
Como funciona o PCR digital
- Particionamento
A mistura de PCR contendo a amostra, primers, sonda e polimerase é dividida em milhares de partições do tamanho de nanolitros. Isso pode ser feito usando um chip com micropoços, gotículas em emulsão de óleo (PCR digital de gotículas) ou outros métodos. Cada partição contém zero ou pelo menos uma cópia do DNA alvo.
- Amplificação
A amostra particionada passa por ciclos térmicos padrão. Em cada partição, a PCR prossegue de forma independente. As partições contendo DNA alvo produzem produto amplificado, enquanto as partições vazias não produzem nenhum.
- Detecção de ponto final
Após amplificação, cada partição é analisada quanto à fluorescência. As partições contendo DNA alvo amplificado são classificadas como positivas (fluorescentes), enquanto aquelas que não contêm são classificadas como negativas. Nenhum ciclo de quantificação (Ct) é necessário – é simplesmente uma leitura de sim ou não por partição.
- Estatísticas de Poisson
Como o particionamento é aleatório, algumas partições podem conter múltiplas cópias do destino. As estatísticas de Poisson são usadas para calcular o número absoluto de moléculas alvo na amostra original com base na proporção de partições negativas.
- Aplicações
A PCR digital é altamente precisa e é usada para quantificar mutações raras, detectar patógenos de baixa abundância, analisar variações no número de cópias e verificar resultados de NGS. É menos sensível aos inibidores de PCR que o qPCR e fornece quantificação absoluta sem padrões.
Fluxo de trabalho prático de dPCR
Prepare a mistura mestre de PCR contendo a amostra de DNA (1–100 ng), primers, sonda e óleo de geração de gotículas. Para PCR digital de gotículas (ddPCR), carregue a mistura em um gerador de gotículas que particiona a amostra em ~20.000 gotículas de nanolitros uniformes em uma emulsão de água em óleo. Para dPCR baseado em chip, a amostra é carregada em um chip microfluídico com micropoços pré-fabricados (normalmente ~20.000 poços). Transfira a amostra particionada para um termociclador e amplifique até o ponto final usando condições de ciclagem padrão. Após a amplificação, leia a fluorescência de cada partição utilizando um leitor dedicado. As partições com DNA alvo apresentam fluorescência acima de um limite definido manualmente e são classificadas como positivas. Aplique a estatística de Poisson: λ = −ln(1 − p) onde p é a fração de partições positivas; a concentração alvo absoluta (cópias/µL) é λ dividida pelo volume da partição. Use pelo menos 10.000 partições aceitas para quantificação confiável. Inclua um controle sem modelo e um controle positivo com número de cópias conhecido. Para detecção de mutações raras, use sondas fluorescentes duplas, uma sonda de tipo selvagem marcada com FAM e uma sonda mutante com HEX, para distinguir moléculas mutantes de moléculas de tipo selvagem na mesma reação.
Aplicação no mundo real
Na biópsia líquida para monitoramento do câncer, o ddPCR detecta mutações no DNA tumoral circulante (ctDNA), como EGFR T790M, no câncer de pulmão de células não pequenas. O DNA plasmático (10 ng) é extraído do sangue e analisado com sondas específicas para mutações. O ddPCR resolve frequências alélicas mutantes tão baixas quanto 0,01%, muito abaixo do limite de detecção do sequenciamento Sanger. O número absoluto de cópias de moléculas mutantes por mL de plasma é calculado, permitindo o rastreamento longitudinal da carga tumoral e a detecção precoce da resistência ao tratamento.
