O sequenciamento Sanger, também conhecido como sequenciamento de terminação de cadeia, é um método usado para determinar a ordem exata dos nucleotídeos em uma molécula de DNA. Desenvolvido por Frederick Sanger em 1977, continua sendo o padrão ouro para validar sequências de DNA e detectar mutações.
Como funciona o sequenciamento Sanger
- Configurando a reação
O DNA a ser sequenciado é misturado com um primer de DNA, DNA polimerase, nucleotídeos normais (dNTPs) e uma pequena quantidade de didesoxinucleotídeos marcados com fluorescência (ddNTPs). Cada um dos quatro ddNTPs é marcado com um corante fluorescente diferente.
- Terminação da Cadeia
A reação começa com a ligação do primer ao DNA modelo. A DNA polimerase estende o primer adicionando dNTPs. Sempre que um ddNTP é incorporado em vez de um dNTP, a cadeia para de crescer porque os ddNTPs não possuem o grupo 3’-hidroxila necessário para maior extensão.
- Geração de Fragmentos
Este processo produz uma mistura de fragmentos de DNA de comprimentos variados, cada um terminando em uma posição específica de nucleotídeo. A etiqueta fluorescente no ddNTP terminal identifica qual base está no final de cada fragmento.
- Eletroforese Capilar
A mistura é carregada em um instrumento de [eletroforese capilar](/guides/eletroforese capilar), onde a separação com base no tamanho é realizada por [eletroforese em gel capilar](/guides/eletroforese em gel capilar). Os fragmentos migram através de uma matriz polimérica dentro do capilar e são detectados por fluorescência induzida por laser à medida que passam pela janela de detecção. Um laser excita os rótulos fluorescentes e um detector registra qual cor passa em cada ponto no tempo.
- Análise de Cromatograma
O instrumento produz um cromatograma – uma série de picos coloridos que representam a sequência de nucleotídeos. A sequência é lida no cromatograma, normalmente do fragmento mais curto para o mais longo, fornecendo a sequência completa do DNA.
Fluxo de trabalho prático de sequenciamento Sanger
Prepare o DNA modelo purificando o produto PCR ou plasmídeo usando um kit de limpeza de coluna. Para sequenciamento de plasmídeo, use 200–500 ng de plasmídeo purificado; para produtos de PCR, use 1–10 ng por 100 pb de amplicon. Configure a reação de sequenciamento do ciclo em um volume de 10 μL: 2 μL de BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 2 μL de tampão de sequenciamento 5×, 1 μL de primer (3,2 pmol/μL), DNA modelo e água para 10 μL. Use o seguinte programa de ciclagem térmica: 96°C por 1 minuto, depois 25 ciclos de 96°C por 10 segundos, 50°C por 5 segundos e 60°C por 4 minutos. Purifique os produtos de extensão por precipitação com etanol ou uma limpeza de esferas magnéticas para remover terminadores de corante não incorporados. Carregue a amostra purificada em um instrumento de eletroforese capilar (por exemplo, Applied Biosystems 3730). A corrida separa os fragmentos por tamanho e um laser excita os corantes fluorescentes à medida que os fragmentos passam pela janela de detecção. Examine o cromatograma resultante usando software como FinchTV, SnapGene ou Chromas. Dados de boa qualidade normalmente se estendem de 600 a 900 bases a partir do primer. Verifique se há picos limpos e espaçados uniformemente com resolução de linha de base. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) aparecem como dois picos sobrepostos na mesma posição. A má qualidade no início (primeiras 20–40 bases) e no final (após 800 bases) é normal – corte essas regiões antes da análise. Solucione problemas de reações que falharam aumentando o modelo, redesenhando os primers com Tm de 60–65°C ou adicionando DMSO (2–5%) para modelos ricos em GC.
Aplicação no mundo real
Para confirmar um gene editado por CRISPR em embriões de camundongos, a região alvo é amplificada por PCR e sequenciada por Sanger. O cromatograma mostra picos mistos próximos ao local do corte, indicando indels. A análise ICE decompõe o traço e relata 72% de eficiência de edição com uma inserção de 1 pb como o alelo mais comum. O sequenciamento Sanger continua sendo o padrão ouro para validar edições de genoma devido à sua precisão e custo-benefício.
