PCR de transcrição reversa (RT-PCR) é uma técnica usada para detectar e amplificar RNA. Ele combina duas etapas: transcrição reversa de RNA em DNA complementar (cDNA), seguida de amplificação PCR do cDNA. Isso permite que os cientistas estudem a expressão genética e detectem vírus de RNA.
Como funciona o RT-PCR
- Extração de RNA
O RNA total é extraído da amostra e tratado com DNase para remover qualquer DNA genômico contaminante. A qualidade e concentração do RNA são verificadas antes de prosseguir.
- Transcrição reversa
O RNA é misturado com enzima transcriptase reversa, primers aleatórios ou oligo-dT e nucleotídeos. A transcriptase reversa usa o RNA como modelo para sintetizar uma fita complementar de DNA. O molde de RNA é então degradado pela RNase H, deixando o cDNA de fita simples.
- Amplificação por PCR
O cDNA é então usado como modelo para PCR padrão com primers específicos do gene. A PCR amplifica o cDNA, produzindo DNA suficiente para visualizar em um gel ou quantificar por qPCR.
- Detecção
Os produtos de PCR amplificados são analisados por eletroforese em gel de agarose. A presença de uma banda no tamanho esperado confirma que o RNA alvo estava presente na amostra original.
- Aplicações
O RT-PCR é amplamente utilizado para medir níveis de expressão gênica, detectar vírus de RNA, como HIV e SARS-CoV-2, validar dados de sequenciamento de RNA e analisar splicing alternativo. Quando combinado com qPCR, torna-se RT-qPCR, permitindo a quantificação de RNA em tempo real.
Protocolo Prático RT-PCR
Comece extraindo o RNA total usando uma coluna de sílica ou um método baseado em TRIzol. Avalie a integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose ou um bioanalisador - o RNA intacto mostra bandas ribossômicas 28S e 18S nítidas com uma proporção 28S:18S próxima de 2:1. Meça a concentração e a pureza por espectrofotometria UV (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Tratar 1–5 µg de RNA com DNase I a 37°C por 30 minutos, depois inativar por calor a 75°C por 10 minutos. Para transcrição reversa, misture o RNA tratado com DNase com hexâmeros aleatórios ou primers oligo-dT (50-250 ng), dNTPs 1 mM e 200 U de transcriptase reversa no tampão fornecido. Incubar a 25°C por 10 minutos, 42°C por 50 minutos e 70°C por 15 minutos. Dilua o cDNA resultante 5–10 vezes antes da amplificação por PCR. Sempre inclua um controle sem transcriptase reversa (sem RT) para detectar contaminação de DNA genômico, se a amostra sem RT produzir um produto de PCR, o DNA residual estará presente. Para primers específicos de genes, projete-os para abranger uma junção exon-exon para evitar a amplificação do DNA genômico; um iniciador direto em um éxon e um iniciador reverso em um éxon a jusante garantem que apenas o cDNA processado seja amplificado.
Aplicação no mundo real
No diagnóstico de SARS-CoV-2, o RT-PCR tem como alvo os genes virais N, E e RdRp usando conjuntos de sondas iniciadoras do CDC ou da OMS. O RNA é extraído de esfregaços nasofaríngeos e o RT-qPCR com sondas duplamente marcadas detecta o RNA viral em limiares de ciclo (Ct) abaixo de 40. Um resultado positivo em dois dos três alvos genéticos confirma a infecção. A inclusão de um controle interno (por exemplo, RNase P humana) verifica a adequação da amostra e o sucesso da extração, evitando falsos negativos devido à coleta inadequada de amostras.
