A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), também conhecida como cromatografia de permeação em gel (GPC) para polímeros orgânicos ou cromatografia de filtração em gel (GFC) para sistemas aquosos, separa moléculas com base em seu volume hidrodinâmico em vez de interação química com a fase estacionária. Uma amostra introduzida na coluna é transportada pela fase móvel através de um leito de partículas porosas. Moléculas maiores que os maiores poros (acima do limite de exclusão) não conseguem entrar nos poros e eluem primeiro. Moléculas suficientemente pequenas para penetrar toda a rede de poros (abaixo do limite de permeação) eluem por último. Entre esses limites, as moléculas eluem em ordem decrescente de tamanho.
A fase estacionária consiste em partículas poliméricas reticuladas com distribuições controladas de tamanho de poro. Materiais comuns incluem poliestireno-divinilbenzeno para SEC orgânica, dextrana (Sephadex), agarose (Sepharose) e poliacrilamida para SEC aquosa. O tamanho do poro é selecionado com base na faixa de peso molecular do analito; colunas com diferentes tamanhos de poro podem ser conectadas em série para estender a faixa de separação. O tamanho de partícula influencia tanto a resolução quanto a contrapressão, com partículas menores (3-5 µm) proporcionando maior eficiência.
A calibração de peso molecular é realizada usando padrões poliméricos de distribuição estreita com peso molecular conhecido, tipicamente poliestireno, poli(metacrilato de metila) ou poli(etilenoglicol), dependendo do tipo de amostra. A curva de calibração plota log(Mw) versus volume de eluição. A partir do cromatograma, calculam-se as médias de peso molecular: média numérica (Mn), média ponderal (Mw) e peso molecular de pico (Mp). O índice de polidispersidade (PDI = Mw/Mn) indica a amplitude da distribuição de pesos moleculares, com PDI = 1 para amostras monodispersas.
As aplicações da SEC concentram-se na caracterização de polímeros, incluindo determinação da distribuição de pesos moleculares, monitoramento de cinéticas de polimerização e análise de composição de copolímeros. A SEC também é empregada em bioquímica para purificação de proteínas e dessalinização (troca de tampão), na indústria de alimentos para análise de polissacarídeos e proteínas, e em análise petroquímica para caracterização de frações pesadas. A SEC aquosa (GFC) é amplamente usada para analisar polímeros solúveis em água, proteínas e ácidos nucleicos sob condições não desnaturantes.
As limitações da SEC devem ser consideradas durante o desenvolvimento do método. Efeitos não relacionados à exclusão por tamanho, como interações eletrostáticas (exclusão ou inclusão iônica em fases estacionárias carregadas) e adsorção hidrofóbica, podem distorcer os perfis de eluição. A concentração da amostra deve ser mantida baixa (tipicamente < 2 mg/mL) para evitar efeitos de dedos viscosos e sobrecarga. A escolha da coluna é crítica: o tamanho do poro deve corresponder à faixa de peso molecular da amostra, e as vazões devem ser mantidas moderadas (0,5-1,0 mL/min) para minimizar a degradação por cisalhamento de polímeros de alto peso molecular.
