Quantitative PCR (qPCR), auch Echtzeit-PCR genannt, ist eine Labortechnik, die DNA in Echtzeit amplifiziert und gleichzeitig quantifiziert. Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR, die nur die endgültige DNA-Menge anzeigt, überwacht qPCR die Ansammlung von DNA während der Reaktion mithilfe von Fluoreszenz.

Wie qPCR funktioniert

1. Reaktionsaufbau

Die Reaktion enthält die gleichen Komponenten wie herkömmliche PCR – Matrizen-DNA, Primer, DNA-Polymerase und Nukleotide – sowie einen fluoreszierenden Reporter. Zwei gängige Reportersysteme sind SYBR Green, ein Farbstoff, der fluoresziert, wenn er an doppelsträngige DNA gebunden wird, und TaqMan-Sonden, bei denen es sich um sequenzspezifische Fluoreszenzsonden handelt.

2. Amplifikation und Detektion

Die Reaktion durchläuft die gleichen thermischen Zyklen wie die Standard-PCR: Denaturierung, Annealing und Verlängerung. Nach jedem Zyklus wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt. Je mehr DNA amplifiziert wird, desto größer wird das Fluoreszenzsignal.

3. Der Ct-Wert

Der Schwellenwertzyklus (Ct) ist die Zykluszahl, bei der das Fluoreszenzsignal über den Hintergrundwert ansteigt. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Ausgangsmenge an Ziel-DNA: Mehr Ausgangs-DNA bedeutet, dass weniger Zyklen erforderlich sind, um den Schwellenwert zu erreichen.

4. Quantifizierung

Bei der absoluten Quantifizierung wird eine Standardkurve bekannter DNA-Konzentrationen verwendet, um die genaue Menge an Ziel-DNA zu berechnen. Bei der relativen Quantifizierung werden die Ct-Werte eines Zielgens mit denen eines Referenzgens verglichen und so die Faltungsänderungen in der Expression bestimmt.

5. Schmelzkurvenanalyse

Bei Verwendung von SYBR Green wird nach der Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Die DNA wird langsam erhitzt, während die Fluoreszenz überwacht wird. Jedes DNA-Produkt schmilzt bei einer charakteristischen Temperatur und bestätigt so, dass das richtige Amplikon produziert wurde und keine Primer-Dimere vorhanden sind.

Praktisches qPCR-Protokoll

Bereiten Sie die Reaktion in einer 96-Well- oder 384-Well-Platte vor. Für SYBR Green mischen Sie 5 µL 2× SYBR Green Mastermix, 0,5 µL jedes Primers (10 µM), 2 µL Template-cDNA oder DNA und Wasser auf 10 µL. Für eine sondenbasierte Detektion ersetzen Sie SYBR Green durch einen 2× Sonden-Mastermix und fügen Sie 0,2–0,4 µM jeder Sonde hinzu. Versiegeln Sie die Platte mit optischer Klebefolie und zentrifugieren Sie sie kurz. Führen Sie das Programm auf einem Echtzeit-Zyklusgerät aus: 2 Minuten bei 95 °C (Polymeraseaktivierung), dann 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 30–60 Sekunden (Annealing und Verlängerung). Sammeln Sie Fluoreszenzdaten am Ende jedes Erweiterungsschritts. Führen Sie nach dem Zyklus eine Schmelzkurvenrampe von 60 °C auf 95 °C durch, wenn Sie SYBR Green verwenden. Erstellen Sie zur absoluten Quantifizierung eine Standardkurve, indem Sie eine bekannte Vorlage seriell verdünnen (10^{7 bis 10}2 Kopien/µL in 10-fachen Schritten). Zeichnen Sie Ct gegen die logarithmische Kopienzahl auf und stellen Sie sicher, dass die Steigung zwischen −3,1 und −3,6 liegt (90–110 % Effizienz). Für die relative Quantifizierung mit der ΔΔCq-Methode berechnen Sie ΔCt = Ct(Ziel) − Ct(Referenz) und dann ΔΔCt = ΔCt(behandelt) − ΔCt(Kontrolle). Faltungsänderung = 2^(−ΔΔCt). Beziehen Sie No-Template-Kontrollen und No-RT-Kontrollen für RNA-basierte Ziele ein. Führen Sie alle Proben in technischen Dreifachexemplaren durch und verwerfen Sie alle mit einer Ct-Standardabweichung > 0,5.

Reale Anwendung

In Genexpressionsstudien für die Krebsforschung quantifiziert RT-qPCR mit SYBR Green die mRNA-Spiegel von Onkogenen wie MYC und Tumorsuppressoren wie TP53. Als Referenzgen dient GAPDH oder ACTB. RNA aus Tumor und angrenzendem normalem Gewebe wird revers transkribiert, und die ΔΔCq-Analyse zeigt, dass MYC in Tumoren um das 8,5-fache hochreguliert ist (p < 0,001). Die Analyse der Schmelzkurve bestätigt ein einzelnes Produkt mit der erwarteten Tm und schließt Primer-Dimer-Artefakte aus.