Colony PCR é uma técnica de triagem rápida usada para determinar se as colônias bacterianas contêm um plasmídeo com a inserção de DNA correta. Em vez de purificar primeiro o DNA plasmídico de cada colônia, a PCR é realizada diretamente em uma pequena quantidade de células bacterianas.
Como funciona o PCR de colônia
- Seleção de Colônia
Colônias bacterianas individuais que crescem em uma placa de ágar são colhidas usando uma ponta de pipeta estéril ou um palito de dente. Cada colônia é tocada brevemente, transferindo uma pequena quantidade de células. A mesma ponta é usada para inocular o tubo PCR e uma placa mestre para cultura posterior.
- Lise Celular
As células bacterianas são aquecidas a 95°C durante vários minutos durante a etapa inicial de desnaturação da PCR. Este tratamento térmico lisa as células, liberando o DNA plasmídico na mistura de reação. O DNA liberado serve então como modelo para amplificação.
- Amplificação por PCR
São utilizados primers que flanqueiam a região de inserção no plasmídeo. Se a colônia contiver um plasmídeo com o inserto correto, a PCR produzirá uma banda no tamanho esperado. Se o plasmídeo estiver vazio (sem inserção), a banda será menor. Se a colónia não contiver o plasmídeo, nenhuma banda será produzida.
- Análise de Gel
Os produtos de PCR são analisados por eletroforese em gel de agarose. As colónias que produzem uma banda com o tamanho de inserção esperado são identificadas como positivas. Essas colônias podem então ser cultivadas para purificação de plasmídeo e análises adicionais.
- Vantagens
A PCR de colônias é rápida e barata, permitindo a triagem de dezenas de colônias em poucas horas. Ele elimina a necessidade de purificação do plasmídeo antes da triagem e é uma primeira etapa padrão nos fluxos de trabalho de clonagem molecular.
Protocolo Prático de PCR de Colônia
Escolha colônias bacterianas individuais de uma placa de ágar seletiva usando uma ponta de pipeta estéril de 10 μL. Toque levemente em uma única colônia – evite transferir um grande aglomerado de células. Coloque a ponta em uma placa mestre fresca (ágar LB em grade com antibiótico) para preservar o clone e, em seguida, mergulhe e agite a mesma ponta em um tubo PCR contendo 20–25 μL de mistura mestre. Para cada colônia, prepare a mistura: 12,5 μL de mistura mestre de PCR 2×, 0,5 μL de cada primer direto e reverso (10 μM), 1 μL de modelo (a colônia) e água para 25 μL. Use primers específicos do vetor flanqueando a inserção (por exemplo, M13 forward/reverse ou T7/SP6) ou primers internos específicos da inserção. Execute a PCR com uma desnaturação inicial prolongada a 95°C durante 5–10 minutos para garantir a lise bacteriana completa e a libertação de ADN. Seguir por 30-35 ciclos de 95°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C por 1 min por kb de inserto esperado, com uma extensão final a 72°C por 5 minutos. Analise 5–10 μL de cada reação por eletroforese em gel de agarose. Uma banda no tamanho de inserção esperado indica um clone positivo. Se nenhuma banda aparecer, a colônia pode não ter o plasmídeo, conter um vetor vazio (produzindo uma banda menor) ou a lise foi insuficiente – reduzindo a quantidade de células bacterianas transferidas. Para bactérias Gram-positivas teimosas, adicione 0,5 μL de lisozima (50 mg/mL) à mistura de PCR ou realize uma lise de congelamento antes da PCR.
Aplicação no mundo real
Ao clonar uma cassete de expressão GFP de 1,2 kb em pET-28a, os transformantes são plaqueados em ágar canamicina. Das 24 colónias rastreadas por PCR de colónia com promotor T7 e iniciadores terminadores, 18 mostram uma banda de 1,2 kb, 4 mostram a banda do vector vazia (300 pb) e 2 não produzem banda. Os 18 clones positivos são utilizados para purificação e sequenciamento de plasmídeos, confirmando a clonagem bem-sucedida em menos de 4 horas.
