O sequenciamento de RNA (RNA-Seq) é uma técnica que usa sequenciamento de próxima geração para analisar o conjunto completo de transcritos de RNA em uma amostra de célula ou tecido. Ele fornece um instantâneo da expressão genética, revelando quais genes estão ativos e em quais níveis.
Como funciona o RNA-Seq
- Extração de RNA
O RNA total é extraído da amostra usando métodos semelhantes ao isolamento do DNA, mas com etapas adicionais para preservar as frágeis moléculas de RNA. A integridade do RNA é verificada por eletroforese em gel ou um bioanalisador.
- Enriquecimento de mRNA ou depleção de rRNA
Como o RNA ribossômico constitui a maior parte do RNA total, ele é removido para enriquecer em RNA mensageiro (mRNA). Isso é feito usando esferas poli-T que capturam as caudas poli-A do mRNA ou esgotando seletivamente as sequências de RNA ribossômico.
- Preparação da Biblioteca
O mRNA enriquecido é fragmentado em pequenos pedaços e transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA) usando primers aleatórios. Os adaptadores são ligados aos fragmentos de cDNA e a biblioteca é amplificada por PCR.
- Sequenciamento
A biblioteca de cDNA é sequenciada em uma plataforma NGS, gerando milhões de leituras curtas. Cada leitura representa uma sequência curta de uma extremidade de um fragmento de cDNA.
- Análise de dados
As leituras são alinhadas a um genoma ou transcriptoma de referência. O número de leituras mapeadas para cada gene é contado para quantificar os níveis de expressão. A análise de expressão diferencial identifica genes que são significativamente regulados para cima ou para baixo entre as condições.
- Aplicações
RNA-Seq é usado para estudar mudanças na expressão gênica no desenvolvimento, doenças, tratamento medicamentoso e respostas ambientais. Ele também pode detectar splicing alternativo, novas transcrições e RNAs não codificantes.
Protocolo prático RNA-Seq
Extraia o RNA total usando TRIzol ou um método baseado em coluna com tratamento DNase na coluna. Avalie a integridade do RNA em um Bioanalyzer ou TapeStation, um Número de Integridade de RNA (RIN) > 7 é necessário para mRNA-Seq, enquanto > 5 pode ser suficiente para RNA-Seq total com depleção de rRNA. Para enriquecimento de mRNA, incubar 0,1-1 μg de RNA total com esferas magnéticas ligadas a oligo poli-T para capturar mRNA poli-adenilado. Alternativamente, use um kit Ribo-Zero para esgotar o rRNA citoplasmático e mitocondrial. Fragmentar o mRNA enriquecido por incubação a 94°C por 8 minutos em tampão de fragmentação, gerando fragmentos de ~200 nt. Sintetize o cDNA da primeira cadeia usando hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa a 25°C por 10 minutos, 42°C por 50 minutos e 70°C por 15 minutos. Substitua a cadeia de RNA por dUTP durante a síntese da segunda cadeia para permitir a especificidade da cadeia - a segunda cadeia contendo dUTP será degradada seletivamente durante a amplificação da biblioteca. Execute o reparo final, a cauda A e a ligação do adaptador como na preparação padrão da biblioteca NGS. Degradar a segunda cadeia marcada com dUTP usando a enzima USER antes do enriquecimento por PCR (10–15 ciclos). Sequencie a biblioteca final em uma plataforma Illumina, gerando de 20 a 40 milhões de leituras emparelhadas por amostra (2 × 75 pb ou 2 × 150 pb). Processe arquivos FASTQ brutos por meio de um pipeline de bioinformática: ajuste de qualidade com cutadapt, alinhe ao genoma de referência usando STAR (modo de 2 passagens para novas junções de splice), quantifique contagens em nível de gene com featureCounts ou HTSeq e identifique genes diferencialmente expressos com DESeq2 ou edgeR usando um limite de taxa de descoberta falsa de 0,05. Inclua pelo menos três réplicas biológicas por condição para poder estatístico.
Aplicação no mundo real
Em um estudo comparando hepatócitos tratados com medicamentos versus hepatócitos de controle, o RNA-Seq identifica 1.247 genes expressos diferencialmente (FDR <0,05). A análise de enriquecimento de vias revela regulação positiva de genes do metabolismo lipídico e regulação negativa de vias inflamatórias. Os dados são validados por RT-qPCR em 10 genes selecionados, confirmando a direção e a magnitude das mudanças de dobramento.
