Visão geral
A proteômica direcionada concentra-se na quantificação de um conjunto predefinido de proteínas com alta sensibilidade, especificidade e rendimento, em contraste com a proteômica de descoberta que visa uma cobertura ampla e não direcionada. A técnica mais amplamente adotada é o monitoramento de reação selecionada (SRM, também chamado de monitoramento de reação múltipla ou MRM) realizado em espectrômetros de massa triplo quadrupolo. Os ensaios SRM têm como alvo transições específicas de peptídeo-precursor-para-fragmento, conhecidas como peptídeos proteotípicos, que representam exclusivamente a proteína de interesse. Essa abordagem oferece precisão quantitativa comparável aos imunoensaios, ao mesmo tempo que oferece maior capacidade de multiplexação e desenvolvimento mais rápido de ensaios.
Métodos
O desenvolvimento do ensaio começa com a seleção de peptídeos proteotípicos: peptídeos que são exclusivos da proteína alvo, voam bem no espectrômetro de massa e produzem íons fragmentados intensos. Para cada peptídeo, várias transições (íon precursor m/z para íon fragmentado m/z) são monitoradas durante o período de eluição cromatográfica. Padrões internos, versões tipicamente estáveis dos peptídeos alvo marcadas com isótopos, são adicionados à amostra em concentrações conhecidas para permitir a quantificação absoluta. Monitoramento de reação paralela (PRM) em instrumentos Orbitrap oferece uma abordagem relacionada com aquisição de espectro total de alta resolução. Métodos de aquisição independente de dados (DIA), como o SWATH-MS, preenchem a lacuna entre a descoberta e a análise direcionada, registrando todos os íons fragmentados de todos os precursores de maneira sistemática.
Protocolo Prático
O desenvolvimento de um ensaio SRM/MRM começa com a identificação de peptídeos proteotípicos para a proteína alvo. Usando bibliotecas espectrais do PeptideAtlas ou SRMAtlas, o pesquisador seleciona peptídeos com 7 a 25 aminoácidos de comprimento, sem locais de clivagem perdidos, evitando metionina e triptofano (que são propensos à oxidação) e produzem fragmentos intensos de íons y ou b a partir de dados de espectrometria de massa. Para cada peptídeo, são selecionadas 3-5 transições - os 3-5 fragmentos de íons mais intensos do espectro da biblioteca. Um peptídeo padrão marcado com isótopo pesado é sintetizado para cada alvo, incorporando arginina ou lisina marcada com 13C/15N para produzir um deslocamento de massa de 6-10 Da. O padrão pesado é adicionado a cada amostra em uma concentração conhecida antes da digestão ou após a digestão, dependendo da estratégia de quantificação. O espectrômetro de massa triplo quadrupolo é configurado com Q1 e Q3 transmitindo os valores m/z do precursor e do fragmento, respectivamente, enquanto Q2 realiza fragmentação induzida por colisão em energias de colisão otimizadas específicas para cada transição. O SRM programado monitora cada transição dentro de uma janela de tempo de retenção de 2 a 3 minutos, maximizando o número de peptídeos quantificados por execução. Os dados brutos são processados no Skyline: os picos cromatográficos são integrados, os tempos de retenção são confirmados em relação ao padrão interno pesado e a proporção da área do pico leve a pesado é calculada. A concentração absoluta é derivada desta relação e da concentração padrão conhecida. Um exemplo do mundo real: um ensaio MRM multiplexado que quantifica 50 proteínas associadas ao câncer no plasma foi desenvolvido para detecção precoce de câncer de pulmão de células não pequenas, alcançando limites de detecção abaixo de 1 ng/mL para 35 dos 50 alvos. O ensaio foi validado em 500 amostras de pacientes com coeficientes de variação abaixo de 15%.
Aplicativos
A proteômica direcionada é o método de escolha para verificar e validar candidatos a biomarcadores descobertos em estudos não direcionados. É amplamente utilizado em pesquisas clínicas para quantificar painéis de proteínas ligadas a doenças específicas. Os ensaios complementam as medições tradicionais ELISA, oferecem uma alternativa às abordagens baseadas em gel e à eletroforese em gel capilar e podem ser multiplexados para rastrear dezenas de proteínas em uma única execução. A integração com a separação de HPLC e a detecção de espectrometria de massa garantem uma quantificação robusta, enquanto os ensaios de quantificação de proteínas fornecem validação ortogonal da concentração total de proteínas.
