L’ultracentrifugation analytique (AUC) est une technique biophysique qui caractérise les macromolécules en solution par leur comportement de sédimentation sous force centrifuge élevée. Elle détermine le poids moléculaire, la forme hydrodynamique, la stœchiométrie de liaison et les constantes d’équilibre sans nécessiter d’étalons ou de calibration de colonne.
Deux expériences complémentaires sont réalisées. La sédimentation vitesse centrifuge les échantillons à grande vitesse et surveille le mouvement radial de la frontière à mesure que les molécules sédimentent. La sédimentation à l’équilibre utilise des vitesses plus faibles où la sédimentation est équilibrée par la diffusion, produisant un gradient de concentration exponentiel à l’équilibre.
La sédimentation vitesse AUC fournit la distribution du coefficient de sédimentation. Le coefficient de sédimentation dépend de la masse moléculaire et du coefficient de friction. Le coefficient de friction renseigne sur la forme moléculaire. Le coefficient de diffusion est obtenu à partir de l’étalement de la frontière. L’équation de Svedberg relie ces paramètres. L’analyse utilisant la distribution c(s) continue dans des programmes comme SEDFIT tient compte des coefficients de sédimentation déconvolués de la diffusion.
La sédimentation à l’équilibre AUC fournit le poids moléculaire indépendamment de la forme. Le gradient de concentration à l’équilibre suit une fonction exponentielle de la position radiale. Pour une espèce unique idéale, le poids moléculaire est déterminé à partir de la pente du graphique ln c en fonction de r. L’analyse multi-composants résout les mélanges et détermine les constantes d’association pour les systèmes en interaction.
Les systèmes de détection incluent l’optique d’absorbance, l’interférométrie de Rayleigh et la détection par fluorescence. La détection par absorbance est spécifique à la longueur d’onde et convient aux échantillons chromophoriques. La détection par interférence mesure les changements de concentration pour tous les solutés et est plus sensible. La détection par fluorescence atteint une sensibilité à la molécule unique pour les échantillons marqués.
Les applications de l’AUC incluent la caractérisation de l’oligomérisation des protéines, l’agrégation des anticorps, les interactions protéine-acide nucléique, l’hétérogénéité des lipoprotéines et la distribution de taille des nanoparticules. La technique est sans marquage et opère dans des conditions de solution native. Elle est considérée comme l’étalon-or pour la détermination des propriétés hydrodynamiques des macromolécules.
Les exigences en matière d’échantillon incluent la transparence optique, une densité et viscosité de tampon appropriées et une concentration suffisante pour la détection. Les concentrations typiques vont de 0,1 à 10 mg/mL pour la détection par absorbance.
