L’apoptose est un processus régulé et énergie-dépendant de mort cellulaire caractérisé par des changements biochimiques et morphologiques distincts. Aucun test unique ne capture tous les aspects, la plupart des expériences utilisent une combinaison de méthodes ciblant différentes caractéristiques.
Tests d’Activité des Caspases
Les caspases sont des protéases à cystéine-aspartate qui exécutent le programme apoptotique. La caspase-3 et -7 sont les caspases exécutrices principales.
Substrats fluorogéniques : une séquence peptidique de reconnaissance (DEVD pour la caspase-3/7) liée à un fluorophore (AMC, AFC). La caspase active clive le peptide, libérant le fluorophore. La fluorescence (ex/em 355/460 nm pour l’AMC) est mesurée dans un lecteur de plaques. Le test est simple, quantitatif et adapté au criblage à haut débit.
Rapporteurs FRET : des cellules exprimant un peptide DEVD flanqué d’une paire de protéines fluorescentes (p. ex., CFP–DEVD–YFP) passent du FRET à l’émission du donneur après clivage par la caspase. Ces rapporteurs permettent le suivi en temps réel de l’apoptose dans les cellules vivantes par microscopie ou cytométrie en flux.
Annexine V / Iodure de Propidium
Dans l’apoptose précoce, la phosphatidylsérine (PS) est translocée du feuillet interne au feuillet externe de la membrane plasmique. L’annexine V se lie à la PS avec une haute affinité de manière dépendante du Ca²⁺. Conjuguée à FITC, PE ou APC, elle marque les cellules apoptotiques précoces.
L’iodure de propidium (PI) est un colorant de l’ADN imperméable à la membrane qui ne pénètre que lorsque la membrane cellulaire est compromise (apoptose tardive ou nécrose). La double coloration distingue :
- Viables : Annexine V⁻/PI⁻
- Apoptotiques précoces : Annexine V⁺/PI⁻
- Apoptotiques tardives : Annexine V⁺/PI⁺
- Nécrotiques : Annexine V⁻/PI⁺
L’analyse est effectuée par cytométrie en flux ou microscopie à fluorescence. Le test doit être réalisé dans les 30 minutes suivant l’ajout de PI, car le PI s’échappe des cellules avec le temps.
Fragmentation de l’ADN
Pendant l’apoptose, les endonucléases (CAD/DFF40) clivent l’ADN entre les nucléosomes, produisant des fragments en multiples de 180–200 pb.
Échelle d’ADN : l’ADN génomique est extrait, séparé sur un gel d’agarose et coloré au bromure d’éthidium. Les cellules apoptotiques montrent un motif d’échelle caractéristique de fragments de 180 pb. C’est un test qualitatif de point final et relativement insensible, nécessite ~10⁶ cellules.
TUNEL : la TdT incorpore des dUTP marqués aux extrémités 3’-OH de l’ADN fragmenté. Le marqueur (biotine, DIG ou fluorophore) est détecté par microscopie ou cytométrie en flux. Le TUNEL marque toutes les cassures d’ADN, y compris celles des cellules nécrotiques, il est donc préférable de le combiner avec une discrimination basée sur la morphologie.
Potentiel de Membrane Mitochondriale
La perte du potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨₘ) est une caractéristique de la voie intrinsèque de l’apoptose. Des fluorophores qui s’accumulent dans les mitochondries en fonction de leur potentiel de membrane sont utilisés :
- JC-1 : émet du vert (monomère) à faible ΔΨₘ et du rouge (agrégats J) à ΔΨₘ élevé. Le rapport rouge/vert indique la polarisation mitochondriale.
- TMRE / TMRM : colorants chargés positivement qui s’accumulent dans les mitochondries polarisées. La perte de fluorescence rouge indique une dépolarisation.
Les Bons Contrôles
Tous les tests d’apoptose nécessitent des contrôles positifs (p. ex., 1 µM de staurosporine pendant 4–6 heures) et négatifs (non traités). Le moment du test est important : l’activité caspase atteint son maximum à 4–8 heures, l’exposition de la PS à 6–12 heures et la fragmentation de l’ADN à 12–24 heures après le stimulus apoptotique.
