L’ATAC-Seq est une méthode d’identification des régions de chromatine ouverte, des zones du génome où l’ADN n’est pas étroitement enroulé autour des nucléosomes et est accessible aux facteurs de transcription et autres protéines régulatrices.

Principe

Un dérivé hyperactif de la transposase Tn5 (complexe transpososome Tn5) fragmente et marque simultanément l’ADN accessible avec des adaptateurs de séquençage dans un processus appelé tagmentation. Les régions de chromatine ouverte sont préférentiellement coupées et marquées par Tn5 car l’ADN lié aux nucléosomes est physiquement inaccessible. Les fragments marqués sont ensuite amplifiés par PCR et séquencés.

Protocole

1. Récolter 50 000 cellules viables (le minimum recommandé). Pour les expériences à faible entrée, aussi peu que 500 cellules peuvent être utilisées.
2. Lyser les cellules dans un tampon de lyse froid (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,1% IGEPAL CA-630) pendant 10 minutes sur glace pour isoler les noyaux intacts.
3. Culotter les noyaux et resuspendre dans un mélange réactionnel de transposition contenant le transpososome Tn5 chargé d’adaptateurs compatibles Illumina.
4. Incuber à 37 °C pendant 30 minutes avec mélange doux.
5. Purifier l’ADN tagmenté en utilisant une colonne ou des billes.
6. Amplifier par PCR pendant 10–15 cycles, en incorporant des index de code-barres.
7. Séquencer sur une plateforme Illumina (paired-end 50 pb est standard).

Analyse des Données

Les lectures brutes sont :

1. Découpées des séquences adaptatrices et alignées sur le génome de référence.
2. Filtrées pour éliminer les lectures mitochondriales (qui peuvent représenter 30–50% des lectures).
3. Corrigées pour le biais d’insertion de Tn5 (Tn5 a une faible préférence de séquence pour certains dinucléotides).
4. Soumises à la détection de pics de chromatine ouverte avec MACS2 ou Genrich.
5. Annotées pour identifier les pics dans les promoteurs, amplificateurs, sites de liaison CTCF et autres éléments régulateurs.

Les pics résultants définissent le paysage de la chromatine accessible. L’accessibilité différentielle entre conditions identifie les éléments régulateurs qui changent d’activité pendant la différenciation, la progression de la maladie ou le traitement médicamenteux.

Contrôle Qualité

• Distribution de taille des fragments : Tn5 produit des fragments de deux tailles. Les fragments libres de nucléosomes sont <100 pb, les fragments mononucléosomiques sont 180–247 pb et les fragments dinucléosomiques sont 315–400 pb. Une bonne banque ATAC-Seq montre un motif d’échelle de nucléosomes clair.
• Fraction de lectures dans les pics (FRiP) : un score FRiP >0,3 indique un bon rapport signal-bruit.
• Enrichissement aux sites de début de transcription (TSS) : les lectures doivent être enrichies aux TSS. Un score d’enrichissement TSS >5 indique une bonne qualité.

Applications

L’ATAC-Seq est utilisé pour identifier les éléments régulateurs (promoteurs, amplificateurs, silencieux), étudier l’empreinte des facteurs de transcription et profiler la dynamique de la chromatine à travers les états et types cellulaires. L’ATAC-Seq en cellule unique (scATAC-Seq) étend la méthode à des cellules individuelles, révélant des paysages régulateurs spécifiques au type cellulaire dans les tissus hétérogènes.

Comparaison avec DNase-Seq et MNase-Seq

L’ATAC-Seq nécessite 10–100× moins de cellules que la DNase-Seq (50 000 vs. 10–50 millions), prend 1–2 jours au lieu de 3–4 jours, et a un flux de travail plus simple (une enzyme au lieu d’une titration à la DNase I). La MNase-Seq cartographie les positions des nucléosomes (pas la chromatine ouverte) et nécessite 10–50 millions de cellules. L’ATAC-Seq a largement remplacé les deux méthodes pour le profilage de routine de l’accessibilité de la chromatine.