La méthylation de l’ADN aux dinucléotides CpG est la modification épigénétique la mieux caractérisée. La conversion au bisulfite combinée au séquençage fournit une lecture quantitative de cette marque à l’échelle du génome.
Chimie du Bisulfite
Le traitement de l’ADN génomique avec du bisulfite de sodium (NaHSO₃) à pH bas (pH 5,0, 50–70 °C, 4–16 heures) désamine les cytosines non méthylées en uracile, tandis que la 5-méthylcytosine (5mC) et la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) sont résistantes à la désamination. Après amplification par PCR, l’uracile est lu comme thymine et la 5mC comme cytosine.
Le taux de conversion doit être >99% pour être fiable. Un contrôle d’ADN de phage lambda non converti est souvent utilisé pour mesurer l’efficacité de conversion.
Méthodes
Séquençage génomique complet au bisulfite (WGBS) : séquençage de tout le génome après conversion au bisulfite. C’est l’étalon-or pour l’analyse complète de la méthylation à résolution de base unique sur tout le génome. Les coûts informatiques sont élevés : une couverture de 30× nécessite ~900 millions de lectures pour le génome humain. Comme l’ADN converti au bisulfite est en grande partie C→T (et G→A sur le brin complémentaire), l’alignement nécessite un index de génome à trois lettres spécialisé (C→T converti sur les deux brins).
Séquençage au bisulfite à représentation réduite (RRBS) : l’ADN génomique est d’abord digéré par une enzyme de restriction insensible à la méthylation (MspI, C↓CGG), qui coupe dans les régions riches en CpG. Les fragments sont sélectionnés par taille (40–220 pb), convertis au bisulfite et séquencés. RRBS enrichit pour les îlots CpG, les promoteurs et autres régions régulatrices à ~10–20% du coût du WGBS.
Séquençage ciblé au bisulfite : des amorces PCR sont conçues pour amplifier des régions spécifiques d’intérêt à partir d’ADN converti au bisulfite. Le produit PCR est séquencé par Sanger ou NGS. Des panels multiplexés ciblés couvrant des centaines de régions sont disponibles commercialement. Cette approche est rentable pour les projets axés sur des panels de gènes spécifiques.
Pyroséquençage : une méthode de séquençage quantitative en temps réel pour des amplicons courts (100–200 pb) d’ADN converti au bisulfite. La hauteur du pic à chaque position C reflète le rapport C (méthylé) à T (non méthylé), donnant un pourcentage de méthylation quantitatif à chaque site CpG. Le pyroséquençage est l’étalon-or pour la validation des marques de méthylation identifiées par puce ou NGS.
Analyse des Données
La méthylation à chaque CpG est rapportée comme une valeur β : β = M / (M + U + 100), où M est les lectures méthylées et U les lectures non méthylées. Les valeurs β vont de 0 (complètement non méthylé) à 1 (complètement méthylé).
L’analyse de méthylation différentielle identifie les positions (DMP) et régions (DMR) différentiellement méthylées entre conditions. La plupart des méthodes utilisent un modèle bêta-binomial pour tenir compte de la couverture variable sur les sites CpG.
Distinction entre 5mC et 5hmC
Le séquençage au bisulfite standard ne peut pas distinguer la 5-méthylcytosine de la 5-hydroxyméthylcytosine, les deux sont protégées de la désamination. Pour détecter spécifiquement la 5hmC, des méthodes supplémentaires sont nécessaires :
- TAB-Seq : la T4-β-glucosyltransférase protège la 5hmC avec du glucose, puis TET1 oxyde la 5mC en 5caC, qui est ensuite convertie en uracile par le bisulfite. Seule la 5hmC est lue comme C.
- oxBS-Seq : le perruthénate de potassium (KRuO₄) oxyde la 5hmC en 5fC, qui est convertie en uracile par le bisulfite. La 5mC reste comme C. La comparaison de l’oxBS-Seq avec la BS-Seq standard donne le niveau de 5hmC par soustraction.
