L’analyse du cycle cellulaire quantifie la proportion de cellules dans chaque phase du cycle de division cellulaire. Les méthodes les plus courantes mesurent le contenu en ADN par cytométrie en flux.
Analyse du Contenu en ADN par Cytométrie en Flux
Les cellules sont fixées et perméabilisées, puis colorées avec un colorant stœchiométrique de l’ADN. L’intensité de fluorescence est proportionnelle au contenu en ADN :
- G0/G1 : contenu en ADN diploïde (2N).
- Phase S : contenu en ADN entre 2N et 4N (synthèse d’ADN en cours).
- G2/M : contenu en ADN tétraploïde (4N).
L’hypothèse clé est que le colorant se lie à l’ADN en proportion directe de la masse. L’iodure de propidium (PI) est le colorant d’ADN le plus courant pour les cellules fixées, mais il se lie également à l’ARN. Une étape de traitement à la RNase A ou RNase T1 est donc essentielle.
Protocole à l’iodure de propidium :
- Récolter 1×10⁶ cellules et laver avec du PBS.
- Fixer dans de l’éthanol à 70% à −20 °C pendant au moins 2 heures (peut être conservé des semaines).
- Laver avec du PBS pour éliminer l’éthanol (vortexer pendant le lavage pour éviter les grumeaux).
- Resuspendre dans un tampon de coloration PI/RNase (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A dans PBS, 0,1% Triton X-100).
- Incuber à 37 °C pendant 30 minutes dans l’obscurité.
- Analyser par cytométrie en flux (échelle linéaire, excitation 488 nm, émission >575 nm).
- Collecter au moins 10 000 événements à faible débit pour un meilleur CV.
Analyse des Données
L’histogramme de contenu en ADN montre des pics à 2N et 4N avec un plateau de phase S entre eux. Les logiciels de modélisation (FlowJo, ModFit, FCS Express) ajustent un modèle mathématique aux données :
- Les pics G0/G1 et G2/M sont modélisés comme des distributions gaussiennes (CV = 2–5% pour des données de haute qualité).
- La phase S est modélisée comme un rectangle large ou un polynôme avec une pente croissante de 2N à 4N.
- Les débris et agrégats sont modélisés par une courbe de débris (exponentielle) et des pics d’agrégats (à 6N, 8N, etc.).
Un CV >8% sur le pic G0/G1 indique des données de mauvaise qualité, grumeaux cellulaires, traitement incomplet à la RNase ou débit trop élevé.
Incorporation de BrdU
La bromodésoxyuridine (BrdU) est un analogue de la thymidine incorporé dans l’ADN pendant la phase S. Après marquage (30–60 minutes), les cellules sont fixées, perméabilisées et colorées avec un anticorps anti-BrdU. L’ADN est contre-coloré avec du 7-AAD ou du DAPI. La cytométrie en flux avec analyse à double paramètre (BrdU vs. contenu en ADN) résout :
- G0/G1 : BrdU faible, ADN 2N.
- Phase S : BrdU élevé, ADN intermédiaire.
- G2/M : BrdU faible, ADN 4N.
- G0 : BrdU très faible, ADN 2N (G0 prolongé peut être distingué de G1 par coloration Ki-67).
La coloration BrdU nécessite une dénaturation partielle de l’ADN (HCl ou DNase I) pour exposer la BrdU incorporée à l’anticorps, ce qui dégrade l’intégrité de l’ADN et peut élargir l’histogramme de contenu en ADN. L’EdU, un analogue de BrdU détecté par chimie click catalysée par le cuivre, évite l’étape de dénaturation et préserve l’analyse de contenu en ADN de haute qualité.
Index Mitotique
Les cellules en mitose (phase M) peuvent être identifiées par coloration de l’histone H3 phosphorylée sur Ser10 (p-H3S10). Cette modification est spécifique des cellules mitotiques. Combinée à l’analyse de contenu en ADN, la coloration p-H3S10 permet de distinguer les cellules mitotiques de la population G2/M plus large.
Pièges Courants
- Doublons : deux cellules G1 passant ensemble devant le laser sont enregistrées comme un seul événement G2/M. Utiliser une porte de discrimination des doublons (FL2-A vs. FL2-W) pour les exclure.
- Population hypodiploïde (sub-G1) : les cellules avec un contenu en ADN <2N sont apoptotiques ou nécrotiques. Si >10% des événements sont sub-G1, les conditions de culture peuvent induire la mort cellulaire.
- Fixation : la fixation au méthanol donne une meilleure résolution du contenu en ADN que l’éthanol mais n’est pas compatible avec tous les marqueurs de surface cellulaire.
