La synchronisation cellulaire est le processus qui consiste à amener toutes les cellules d’une culture à la même phase du cycle cellulaire. Elle permet des études dépendantes du cycle cellulaire sans méthodes de résolution unicellulaire.

Méthodes Chimiques

Blocage à la thymidine. L’excès de thymidine (2 mM) inhibe la ribonucléotide réductase, épuisant le pool de dCTP et arrêtant la synthèse d’ADN. Les cellules s’accumulent à la frontière G1/S. Un blocage unique arrête la plupart des cellules à G1/S en 12–24 heures. Un double blocage à la thymidine (blocage 16–18 heures, libération 8–10 heures, blocage à nouveau 16–18 heures) atteint >90 % de synchronisation à G1/S. Le second blocage rattrape les cellules qui sont passées par la phase S pendant la première libération.

La libération est effectuée en éliminant la thymidine avec du milieu frais. Après libération, la population progresse de manière synchrone à travers les phases S, G2 et M. La synchronie se dégrade à chaque cycle cellulaire en raison de la variation naturelle des taux de progression du cycle cellulaire.

Hydroxyurée. Inhibe la ribonucléotide réductase de manière similaire à la thymidine. Utilisée à 1–2 mM pendant 12–24 heures. L’hydroxyurée est moins toxique que la thymidine et arrête les cellules à la frontière G1/S avec une bonne réversibilité. Le principal inconvénient est qu’elle provoque des dommages à l’ADN (stress de réplication), ce qui peut confondre les expériences étudiant les réponses aux dommages de l’ADN.

Nocodazole. Dépolymérise les microtubules, arrêtant les cellules en phase M au point de contrôle métaphase–anaphase (point de contrôle du fuseau mitotique). Utilisé à 50–100 ng/mL pendant 12–18 heures. L’indice mitotique peut atteindre >90 %. Les cellules mitotiques s’arrondissent et se détachent de la surface de culture, elles peuvent être récoltées par secouage sans trypsinisation, une méthode appelée secouage mitotique. La libération est rapide (les cellules sortent de la mitose en 30–60 minutes après lavage) mais l’arrêt est toxique s’il est prolongé au-delà de 18 heures.

Colchicine. Mécanisme similaire au nocodazole mais plus toxique et moins réversible. Utilisée à 50–100 ng/mL. La colchicine est plus couramment utilisée pour les préparations cytogénétiques (étalement des chromosomes) que pour les dosages fonctionnels.

Mimosine. Un acide aminé végétal qui inhibe l’initiation de la réplication de l’ADN, arrêtant les cellules en G1 tardif (pas à G1/S). Utilisée à 0,5–2 mM pendant 12–24 heures. La mimosine est moins couramment utilisée que la thymidine mais a l’avantage d’arrêter en G1 plutôt qu’à la frontière G1/S, ce qui est utile pour étudier les événements précoces de G1.

Privation de Sérum

L’élimination du sérum du milieu de culture pendant 24–72 heures pousse les cellules en G0 (quiescence). Après réajout de sérum, les cellules réintègrent le cycle cellulaire en G1. La méthode est simple et largement utilisée pour les cellules primaires et les fibroblastes. L’efficacité de la synchronisation G0/G1 varie selon le type cellulaire, les cellules HEK 293 sont largement insensibles à la privation de sérum, tandis que les NIH 3T3 s’arrêtent efficacement.

La privation de sérum provoque des changements globaux dans le métabolisme, la signalisation (mTOR, MAPK) et l’expression génique qui ne se limitent pas à l’arrêt du cycle cellulaire. Elle ne doit pas être utilisée pour les expériences où les niveaux de base métaboliques ou de signalisation sont critiques.

Méthodes Physiques

Secouage mitotique. Pendant le blocage au nocodazole ou même en croissance logarithmique, les cellules mitotiques s’arrondissent et se détachent. Un tapotement doux du flacon de culture les détache dans le milieu. Les cellules récoltées sont >95 % mitotiques et peuvent être replaquées pour une progression synchrone en G1. Le rendement est faible (1–3 % de la population) et la méthode ne fonctionne que pour les cellules adhérentes.

Élutriation centrifuge. Les cellules sont séparées par taille dans une centrifugeuse à contre-courant, les grandes cellules (G2/M) sédimentent plus vite, les petites cellules (G1) s’éluent en premier. La méthode nécessite un équipement spécialisé (Beckman JE-5.0 ou similaire) mais produit des populations synchrones sans perturbation chimique. Elle fonctionne pour les cellules adhérentes et en suspension et peut produire 10⁸–10⁹ cellules synchronisées par cycle.

Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) . Les cellules colorées avec un colorant vital de l’ADN (Hoechst 33342) sont triées en populations G1, S et G2/M. La méthode produit des populations hautement pures (>99 %) mais le processus de tri est stressant et le rendement est faible (10⁶–10⁷ cellules par heure).

Vérification

L’efficacité de la synchronisation doit être vérifiée, généralement par analyse du cycle cellulaire utilisant la coloration à l’iodure de propidium et la cytométrie en flux. La fraction de cellules dans la phase cible doit être >80–90 % pour une synchronisation réussie. Pour la synchronisation mitotique, la coloration p-H3S10 est utilisée.

Choix d’une Méthode

Les méthodes chimiques sont les plus accessibles mais peuvent introduire des artéfacts. Les méthodes physiques évitent les produits chimiques mais nécessitent un équipement spécialisé ou produisent moins de cellules.