La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) est une technique d’imagerie optique qui améliore la résolution et le contraste en éliminant la lumière hors foyer. Un diaphragme sténopéique placé devant le détecteur bloque la lumière provenant des plans au-dessus et en dessous du plan focal, de sorte que seule la lumière du point focal atteint le détecteur. Cette capacité de sectionnement optique permet l’imagerie d’échantillons épais et la reconstruction tridimensionnelle.
Dans un microscope confocal, un faisceau laser est élargi et dirigé à travers la lentille d’objectif vers un point limité par diffraction dans l’échantillon. Les molécules fluorescentes dans le volume focal sont excitées et émettent une lumière qui est collectée par le même objectif. Un miroir dichroïque sépare les chemins d’excitation et d’émission, et un diaphragme sténopéique variable dans le plan image conjugué rejette l’émission hors foyer. Un tube photomultiplicateur ou une photodiode à avalanche détecte le signal.
Le faisceau est balayé en rastaférisation sur l’échantillon à l’aide de miroirs galvanométriques, construisant l’image pixel par pixel. La vitesse de balayage varie typiquement de 0,5 à 4 images par seconde à 512×512 pixels. Les scanners résonants atteignent une imagerie à vitesse vidéo pour les applications sur cellules vivantes.
La résolution latérale de la microscopie confocale est d’environ 0,2 µm et la résolution axiale d’environ 0,5 µm avec des objectifs à haute ouverture numérique. La résolution dépend de la longueur d’onde d’excitation et de l’ouverture numérique de l’objectif. Le diamètre du sténopé est réglé à 0,5–1 unité Airy pour équilibrer résolution et intensité du signal.
L’imagerie multicanaux excite séquentiellement plusieurs fluorophores en utilisant différentes lignes laser et détecte l’émission à travers des détecteurs séparés ou des canaux spectraux. Les fluorophores courants incluent le DAPI, le FITC, le TRITC, le Cy3, le Cy5 et les colorants Alexa. Le démélange spectral sépare les spectres d’émission qui se chevauchent.
L’acquisition de piles Z collecte une série de coupes optiques à différentes profondeurs focales. La projection d’intensité maximale et le rendu volumique reconstruisent les structures tridimensionnelles. L’imagerie en accéléré capture les processus dynamiques dans les spécimens vivants. Le FRAP (récupération de fluorescence après photoblanchiment) mesure la mobilité moléculaire. La photoactivation et la photoconversion suivent des sous-populations spécifiques.
Les applications couvrent la biologie cellulaire, la neurobiologie, la biologie du développement et la science des matériaux. La CLSM image l’organisation du cytosquelette, la signalisation intracellulaire, la dynamique membranaire et la localisation subcellulaire dans les cellules fixes et vivantes. En science des matériaux, la CLSM caractérise la topographie de surface, l’épaisseur des revêtements et la distribution des particules.
