Aperçu
L’épigénomique est l’étude à l’échelle du génome des modifications épigénétiques – des changements chimiques dans l’ADN et la chromatine qui régulent l’expression des gènes sans altérer la séquence d’ADN sous-jacente. Ces modifications incluent la méthylation de l’ADN au niveau des dinucléotides CpG, les modifications post-traductionnelles des histones (telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation) et les modèles d’accessibilité de la chromatine. Les cartes épigénomiques varient selon les types de cellules, les stades de développement et les états pathologiques, fournissant une couche dynamique d’informations qui complète le génome statique. Des projets à grande échelle tels que les consortiums ENCODE et Roadmap Epigenomics ont produit des atlas épigénomiques complets pour des centaines de types de cellules humaines.
Méthodes
Le profilage épigénomique repose sur des techniques adaptées au séquençage à haut débit. Le séquençage bisulfite du génome entier (WGBS) convertit les cytosines non méthylées en uracile, permettant ainsi des cartes de méthylation à résolution unique. ChIP-seq utilise des anticorps pour immunoprécipiter des modifications spécifiques d’histone ou des régions liées à un facteur de transcription, suivi d’un séquençage. ATAC-seq et DNase-seq cartographient les régions ouvertes de la chromatine pour identifier les éléments régulateurs actifs. Hi-C et les méthodes associées capturent la conformation tridimensionnelle de la chromatine. Les pipelines bioinformatiques traitent les lectures brutes via l’alignement, l’appel de pic (à l’aide de MACS2 ou PeakDene) et l’analyse d’enrichissement différentiel. L’analyse intégrative combinant plusieurs pistes épigénomiques révèle des états de la chromatine, tels que des promoteurs actifs, des amplificateurs et des régions réprimées, à l’aide d’outils tels que ChromHMM.
### Candidatures
L’épigénomique a transformé notre compréhension du développement, du vieillissement et des maladies. Les modèles aberrants de méthylation de l’ADN sont des caractéristiques du cancer, l’inactivation du gène suppresseur de tumeur par hyperméthylation du promoteur étant désormais une cible thérapeutique. Le profilage épigénomique guide la découverte d’amplificateurs et d’autres éléments régulateurs étudiés dans la régulation des gènes et l’épigénétique. La technique est étroitement liée à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) mais adaptée à l’ensemble du génome. L’épigénomique éclaire également la façon dont le timing de la réplication de l’ADN est en corrélation avec l’état de la chromatine, et comment les expositions environnementales laissent des marques épigénétiques durables qui influencent les résultats de santé tout au long de la vie.
Protocole pratique
Pour le séquençage bisulfite du génome entier (WGBS), commencez avec 100 à 500 ng d’ADN génomique enrichi de 0,5 % d’ADN de phage lambda non méthylé comme contrôle de conversion. Fragmentez l’ADN par sonication à 200-400 pb, puis effectuez la réparation des extrémités, la queue A et la ligature de l’adaptateur. Traitez avec du bisulfite de sodium à l’aide du kit EZ DNA Méthylation-Gold, qui convertit les cytosines non méthylées en uracile tout en laissant les cytosines méthylées intactes. PCR amplifier (12 cycles) avec une polymérase tolérante à l’uracile (par exemple, PfuTurbo Cx) et séquencer des extrémités appariées de 150 pb. Alignez les lectures avec Bismark : bismark --genome genome_dir -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o bismark_output. Supprimez les lectures en double avec deduplicate_bismark. Extraire les appels de méthylation : bismark_methylation_extractor --gzip --bedGraph --counts --buffer_size 10G bismark_output.bam. La sortie inclut les pourcentages de méthylation par CpG dans un fichier de rapport bedGraph ou CX. Pour l’analyse différentielle de méthylation, utilisez « methylKit » dans R : « methRead » pour importer des fichiers de couverture, « calculateDiffMeth » pour identifier des cytosines ou des régions différentiellement méthylées avec une valeur q < 0,05 et une différence de méthylation > 25 %. Pour l’analyse de modification d’histone ENCODE ChIP-seq, traitez les lectures brutes via le pipeline ENCODE : alignez-vous avec Bowtie2, filtrez les doublons, appelez les pics avec MACS2 en utilisant le mode --broad pour H3K27me3 ou H3K36me3 et générez des pistes de signal avec bedClip et bedGraphToBigWig. La segmentation de l’état de la chromatine avec ChromHMM combine plusieurs marques d’histones (H3K4me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K36me3, H3K27me3) dans un modèle combinatoire : java -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 200 binarized_beds output_dir 15 hg38. Le modèle à 15 états segmente le génome en promoteurs actifs, amplificateurs, régions transcrites, domaines Polycomb réprimés et hétérochromatine.
