Aperçu
La génomique fonctionnelle vise à combler l’écart entre la séquence du génome et la fonction biologique en caractérisant systématiquement les rôles des gènes, leurs produits et leurs interactions à l’échelle du génome. Alors que la génomique structurelle fournit le modèle statique de l’ADN d’un organisme, la génomique fonctionnelle s’interroge sur ce que fait chaque élément, quand et où il est actif et comment il participe aux réseaux cellulaires. Le domaine intègre des données provenant de criblages de transcriptomique, de protéomique et de perturbations à haut débit pour attribuer une fonction biologique à chaque gène. Cette perspective au niveau systémique est devenue essentielle pour comprendre des phénotypes complexes.
Méthodes
Plusieurs approches à haut débit alimentent la génomique fonctionnelle. Les écrans de perte de fonction utilisent des bibliothèques d’interférence ARN (ARNi) ou CRISPR-Cas9 pour éliminer systématiquement les gènes et observer les conséquences phénotypiques. Écrans de gain de fonction surexpriment les bibliothèques d’ADNc pour identifier les gènes qui déterminent des phénotypes particuliers. La cartographie des interactions protéiques (via la spectrométrie de masse à deux hybrides de levure ou par purification par affinité) construit des réseaux d’interactions à l’échelle du génome. Le profilage de l’expression génique à l’aide de RNA-seq ou de puces à ADN révèle des modèles de co-expression qui suggèrent des relations fonctionnelles. L’intégration de divers types de données grâce à l’apprentissage automatique prédit la fonction des gènes avec une précision croissante, en attribuant des annotations telles que des termes d’ontologie génétique basées sur des preuves multi-omiques.
### Candidatures
La génomique fonctionnelle stimule la découverte dans tous les domaines de la vie. Dans la recherche sur le cancer, les cribles CRISPR identifient les gènes essentiels à la croissance tumorale et les gènes dont la perte confère une résistance aux médicaments. En microbiologie, les tests d’aptitude à l’échelle du génome identifient les gènes nécessaires à la pathogenèse. Les applications agricoles comprennent l’identification de gènes contrôlant le rendement, la tolérance au stress et le contenu nutritionnel grâce à une technologie de l’ADN recombinant et un criblage fonctionnel. Le domaine continue d’évoluer avec les technologies unicellulaires et les écrans CRISPR in vivo qui révèlent la fonction des gènes dans des contextes tissulaires natifs, nous rapprochant ainsi d’une annotation fonctionnelle complète du génome.
Protocole pratique
Pour une expérience ChIP-seq visant à identifier les sites de liaison des facteurs de transcription, commencez par réticuler les cellules en utilisant 1 % de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante, puis éteignez-les avec de la glycine. La chromatine est cisaillée en fragments de 200 à 600 pb par sonication (par exemple, Covaris ou Diagenode Bioruptor). L’immunoprécipitation utilise 2 à 5 µg d’anticorps spécifique de la cible couplés à des billes magnétiques de protéine A/G pendant une nuit à 4°C. Après lavage, réticulation inverse à 65°C pendant 6 heures avec la protéinase K, puis purifier l’ADN avec nettoyage de la colonne. Les bibliothèques sont préparées avec réparation des extrémités, A-tailing, ligature de l’adaptateur et 12 à 15 cycles de PCR. Séquence sur Illumina avec des lectures single-end de 50 pb. Exécutez le pipeline ENCODE ATAC-seq pour le profilage ouvert de la chromatine sur des cellules congelées ou fraîches : les noyaux sont isolés par incubation dans un tampon de lyse, puis étiquetés avec la transposase Tn5 à 37°C pendant 30 min : tagment --input 50000 cellules --output tagmented.bam. La PCR s’amplifie avec des amorces à code-barres pendant 8 à 12 cycles et séquence les extrémités appariées. Pour l’analyse des données, alignez les lectures avec « Bowtie2 » en utilisant « –very-sensitive » pour ATAC-seq ou « BWA » pour ChIP-seq. Supprimez les doublons avec Picard MarkDuplicates. Appel de pointe avec MACS2 : macs2 callpeak -t aligné.bam -c input.bam -f BAMPE -g hs -n sample -q 0.05. Pour les marques d’histones comme H3K4me3, utilisez le mode de crête large avec --broad. Les mesures de qualité incluent la fraction de lectures dans les pics (FRiP > 1 % pour les facteurs de transcription, > 10 % pour les marques d’histone), NSC (coefficient de brin normalisé > 1,05) et RSC (corrélation relative des brins > 0,8). L’analyse de liaison différentielle entre les conditions utilise « DiffBind » dans R, et l’enrichissement des motifs est testé avec « HOMER » ou « MEME-ChIP ».
