Le criblage à haut débit (HTS) est un processus automatisé qui teste de grands nombres de composés contre des cibles biologiques pour identifier des points de départ pour la découverte de médicaments ou la recherche en biologie chimique. Une campagne HTS bien conçue intègre le développement de tests, l’automatisation, l’analyse de données et la validation des hits.
Développement de tests
Le fondement de toute campagne HTS est un test robuste et reproductible. Le test doit mesurer une activité biologique spécifique dans un format adapté à l’automatisation et à la miniaturisation. Les tests biochimiques utilisent des protéines purifiées pour mesurer l’inhibition enzymatique, la liaison à un récepteur ou les interactions protéine-protéine. Les tests cellulaires mesurent la viabilité, l’expression de gènes rapporteurs ou les changements phénotypiques.
Les paramètres clés du développement de tests incluent le rapport signal-sur-bruit, le rapport signal-sur-bruit de fond et le facteur Z, qui quantifie la qualité du test pour le HTS. Un facteur Z supérieur à 0,5 indique un test excellent. Le coefficient de variation doit être faible, généralement inférieur à 10 %.
La miniaturisation des tests réduit la consommation de réactifs et augmente le débit. Les tests HTS modernes sont réalisés dans des plaques 384 puits ou 1536 puits avec des volumes totaux de 5–50 µL. Les tests homogènes qui ne nécessitent pas d’étapes de lavage sont préférés pour la rapidité et la simplicité.
Technologies de détection
Les lectures basées sur la fluorescence sont les plus courantes en HTS. L’intensité de fluorescence, la polarisation de fluorescence, le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) et le FRET résolu en temps (TR-FRET) sont largement utilisés. Les tests de luminescence, incluant les tests rapporteurs basés sur la luciférase de luciole et le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET), offrent une sensibilité élevée et un faible bruit de fond.
La technologie AlphaScreen utilise la chimiluminescence sur billes et est particulièrement utile pour détecter les interactions biomoléculaires. Les tests basés sur l’absorbance sont simples et robustes mais moins sensibles. Les approches sans marquage telles que la résonance plasmonique de surface (SPR) et la spectrométrie de masse peuvent détecter la liaison directement sans marqueurs fluorescents.
Bibliothèques de composés
Les bibliothèques HTS contiennent généralement des centaines de milliers à des millions de composés. Les bibliothèques de diversité visent à couvrir un large espace chimique, tandis que les bibliothèques ciblées se concentrent sur des familles de protéines spécifiques telles que les kinases ou les RCPG. Les bibliothèques de fragments contiennent des composés de faible poids moléculaire pour le criblage basé sur les fragments.
La qualité des bibliothèques est évaluée par la pureté, la stabilité et les propriétés physicochimiques des composés. La règle de cinq de Lipinski guide les propriétés de type médicament : poids moléculaire inférieur à 500 Da, logP inférieur à 5, pas plus de 5 donneurs de liaisons hydrogène et pas plus de 10 accepteurs de liaisons hydrogène. Les composés d’interférence pan-assay (PAINS) sont signalés comme des hits fréquents produisant des faux positifs par des mécanismes non spécifiques.
Automatisation et robotique
Le HTS repose sur des systèmes robotiques intégrés qui gèrent le stockage des plaques, la distribution de liquides, l’incubation, le lavage et la détection. Les laveurs de plaques, les pipetteurs multicanaux et les éjecteurs de gouttelettes acoustiques permettent une manipulation précise des liquides à des volumes nanolitriques. Le contrôle environnemental maintient la température, l’humidité et les niveaux de CO2 pour les tests cellulaires.
Le débit de criblage est mesuré en plaques par jour ou en composés par semaine. Une campagne HTS typique de 100 000 composés en format 384 puits nécessite environ 260 plaques. Les plateformes ultra-HTS peuvent cribler plus d’un million de composés par jour.
Analyse des données et sélection des hits
Les données du criblage primaire sont normalisées et corrigées pour les variations entre plaques. Le pourcentage d’inhibition ou d’activité est calculé par rapport aux témoins positifs et négatifs. Le score Z mesure le nombre d’écarts types par rapport à la moyenne de la plaque. Les seuils de sélection des hits sont généralement fixés à 3 écarts types au-dessus de la moyenne ou à un pourcentage d’inhibition spécifique.
La confirmation des hits implique un nouveau test dans le test primaire et un test de l’activité dépendante de la concentration. Les contre-tests éliminent les composés qui interfèrent avec la technologie de détection plutôt qu’avec la cible. Les tests de sélectivité évaluent l’activité contre des cibles apparentées. Les composés promiscuitaires sont identifiés par leurs relations structure-activité plates et leur activité dans plusieurs tests non apparentés.
Du hit au candidat et optimisation du lead
Les hits confirmés subissent une optimisation par chimie médicinale pour améliorer la puissance, la sélectivité et les propriétés de type médicament. Les études de relation structure-activité (SAR) identifient les groupes fonctionnels clés responsables de l’activité. Le profilage ADME (absorption, distribution, métabolisme, excrétion) évalue les propriétés pharmacocinétiques. Les études d’efficacité in vivo dans des modèles animaux valident le potentiel thérapeutique des candidats optimisés.
