La calorimétrie de titration isotherme (ITC) est une technique sans marquage qui mesure directement le changement de chaleur accompagnant une interaction de liaison. C’est la seule méthode qui fournit une caractérisation thermodynamique complète de la liaison, incluant la constante d’association à l’équilibre (Ka), l’énergie libre de Gibbs (ΔG), le changement d’enthalpie (ΔH), le changement d’entropie (ΔS) et la stœchiométrie de liaison (n) à partir d’une seule expérience.
Dans une expérience ITC, une solution de ligand est injectée en petits aliquots dans une cellule d’échantillon contenant la macromolécule à température constante. Chaque injection produit une impulsion thermique à mesure que les molécules de ligand se lient à la cible. Lorsque les sites de liaison deviennent saturés, le signal thermique diminue jusqu’à ce qu’il ne reste que la chaleur de dilution. La cellule de référence contient uniquement du tampon et l’instrument mesure la puissance différentielle nécessaire pour maintenir des températures identiques entre les deux cellules.
Le thermogramme résultant représente la chaleur par injection en fonction du temps. L’intégration de chaque pic donne la chaleur cumulative libérée ou absorbée en fonction du rapport molaire ligand/macromolécule. La régression non linéaire de l’isotherme de liaison utilisant un modèle de liaison approprié donne Ka, ΔH et n. Le ΔG est calculé à partir de Ka, et ΔS est dérivé de ΔG = ΔH - TΔS.
L’ITC peut mesurer des constantes d’association de 103 à 109 M−1. La limite de détection dépend de l’ampleur de l’enthalpie de liaison et de la concentration des réactifs. Les expériences typiques nécessitent des concentrations de 10 à 100 µM de macromolécule dans la cellule et des concentrations de ligand 10 à 100 fois plus élevées dans la seringue.
Les considérations de conception expérimentale incluent l’optimisation de la valeur c (produit de la concentration du récepteur et de Ka), la sélection des volumes d’injection et la détermination de la chaleur de dilution en injectant le ligand dans le tampon seul. La composition du tampon, le pH et la température doivent être appariés entre l’échantillon et la référence.
Les applications incluent la caractérisation des interactions enzyme-inhibiteur, les liaisons protéine-protéine, les interactions protéine-ADN et la reconnaissance anticorps-antigène. L’ITC mesure également la cinétique enzymatique, les interactions des protéines membranaires et la formation de la couronne protéique des nanoparticules.
