Aperçu
L’analyse des données des puces à ADN transforme les intensités de fluorescence brutes des puces à ADN hybridées en mesures significatives de l’expression génique. Bien que l’ARN-seq ait largement supplanté les micropuces pour les études basées sur la découverte, les micropuces restent largement utilisées dans les diagnostics cliniques, la sélection végétale et les études sur de grandes populations en raison de leur faible coût, de leurs protocoles standardisés et de leurs pipelines d’analyse bien établis. Un seul micropuce peut mesurer l’expression de dizaines de milliers de transcrits simultanément en exploitant l’appariement de bases complémentaires entre l’échantillon d’ADNc et les sondes immobilisées. Le flux de travail d’analyse aborde les caractéristiques techniques uniques des données de micropuces, notamment la correction de l’arrière-plan, la normalisation et la synthèse au niveau de la sonde.
Méthodes
L’analyse des puces à ADN commence par le traitement de l’image pour extraire les intensités au niveau de la sonde. La correction d’arrière-plan supprime le signal non spécifique à l’aide de méthodes telles que la moyenne robuste multi-array (RMA) ou l’ajustement du contenu GC. La normalisation rend les tableaux comparables : la normalisation quantile est l’approche la plus courante pour les tableaux à une couleur, tandis que la normalisation lœss est appliquée aux conceptions bicolores. Résumé des sondes (pour les matrices Affymetrix, utilisant RMA ou PLIER) combine plusieurs sondes par gène en une seule valeur d’expression. L’évaluation de la qualité utilise des pseudo-images, des tracés NUSE et des tracés RLE pour identifier les tableaux problématiques. L’expression différentielle est testée avec Limma, qui utilise la modération empirique de Bayes pour stabiliser les estimations de variance entre les gènes. Les effets de lot sont détectés avec l’analyse des composants principaux et corrigés à l’aide de ComBat ou de RemoveBatchEffect de Limma.
### Candidatures
Malgré l’essor du séquençage, les puces à ADN continuent d’apporter de la valeur. Les tests MammaPrint et Oncotype DX approuvés par la FDA utilisent des puces à ADN pour le pronostic du cancer du sein. Des panels cliniques puces à ADN et expression génique guident les décisions de traitement en oncologie et dans le diagnostic des maladies rares. L’analyse des données de puces à ADN prend également en charge la validation des résultats de la qPCR via des études de corrélation qPCR et complète le séquençage de l’ADN en profilant l’expression à grande échelle. En génomique agricole, les puces à ADN permettent une cartographie rentable des caractères et une sélection assistée par marqueurs au sein de grandes populations reproductrices.
Protocole pratique
Pour l’analyse de puces à ADN Affymetrix dans R/Bioconductor, commencez par lire les fichiers CEL avec le package « oligo » ou « affy ». Créez un ExpressionFeatureSet : data <- read.celfiles(list.celfiles()). Effectuez la normalisation RMA en une seule étape avec eset <- rma(data), qui applique la correction d’arrière-plan (convolution des distributions de signal et de bruit), la normalisation quantile sur les tableaux et la synthèse au niveau de la sonde via le polissage médian. La matrice d’expression résultante contient des valeurs transformées en log2 prêtes pour l’analyse. Évaluez la qualité du tableau avec les tracés « NUSE » (Normalized Unscaled Standard Error) et « RLE » (Relative Log Expression) ; les tableaux avec une médiane NUSE supérieure à 1,05 ou des intervalles interquartiles RLE s’écartant de la norme doivent être signalés. Les tests d’expression différentielle utilisent limma : ajustez d’abord un modèle linéaire avec fit <- lmFit(eset, design) où design est une matrice de modèle créée avec model.matrix(~ condition). Appliquez ensuite la modération empirique de Bayes avec fit2 <- eBayes(fit) et extrayez les résultats avec topTable(fit2, coef = 2, number = Inf, ajuster = "BH"). Le résultat comprend les modifications logarithmiques, l’expression moyenne, les statistiques t modérées, les valeurs p et les valeurs p ajustées par Benjamini-Hochberg. Pour les tableaux bicolores, utilisez limma avec normalizeWithinArrays (normalisation loess) et normalizeBetweenArrays (normalisation d’échelle). Les effets de lot identifiés dans les tracés PCA peuvent être corrigés avec ComBat(dat, batch) du package sva. Visualisez les résultats avec des tracés de volcan, des cartes thermiques des sondes les plus exprimées différentiellement et des tracés MA pour inspecter les biais dépendants de l’intensité. Annotez les sondes sur les gènes à l’aide du package d’annotation spécifique à la plate-forme (par exemple, « hgu133plus2.db » pour les matrices Human Genome U133 Plus 2.0).
