Les dosages de gènes rapporteurs sont une pierre angulaire de la biologie moléculaire pour étudier la régulation des gènes. Un gène rapporteur code une protéine dont l’activité est facilement mesurable, et il est placé sous le contrôle d’un promoteur ou d’un élément régulateur d’intérêt.

Rapporteurs Courants

• Luciférase de luciole (de Photinus pyralis) : catalyse l’oxydation de la D-luciférine, produisant de la lumière à 560 nm. Le signal est mesuré avec un luminomètre. Il a une très large gamme dynamique (7–8 ordres de grandeur) et pratiquement aucun bruit de fond dans les cellules de mammifères.
• Luciférase Renilla (de Renilla reniformis) : utilise la coelentérazine comme substrat, émettant à 480 nm. Elle est couramment utilisée comme rapporteur de contrôle pour la normalisation dans les dosages double-luciférase.
• Protéine fluorescente verte (GFP) : de Aequorea victoria, fluoresce à 509 nm lorsqu’elle est excitée à 395 nm. Les variantes couvrent tout le spectre visible (CFP, YFP, RFP, mCherry). La fluorescence peut être mesurée par fluoromètre, cytomètre en flux ou microscopie, permettant l’analyse en cellules vivantes et unicellulaire.
• β-Galactosidase (LacZ) : clive le X-gal pour produire un précipité bleu (colorimétrique) ou l’ONPG pour produire un produit jaune (absorbance à 420 nm). Simple et peu coûteuse mais moins sensible que la luciférase.
• SEAP (phosphatase alcaline sécrétée) : sécrétée dans le milieu de culture, permettant un échantillonnage répété de la même culture sans lyser les cellules. Mesurée par un substrat chimiluminescent.
• CAT (chloramphénicol acétyltransférase) : le rapporteur classique, détecté par ELISA ou dosage radioactif. Maintenant largement remplacé par la luciférase et la GFP.

Dosages Double-Luciférase

Les dosages double-luciférase utilisent la luciférase de luciole et la luciférase Renilla dans le même échantillon. Le promoteur test pilote la luciférase de luciole, et un promoteur constitutif (par exemple, SV40, TK) pilote la luciférase Renilla comme contrôle interne. Après avoir mesuré la luminescence de la luciférase de luciole, un réactif l’éteint et active la luminescence Renilla. Le rapport luciférase de luciole/Renilla normalise l’efficacité de transfection et le nombre de cellules.

Applications

Les dosages rapporteurs sont utilisés pour :

• Cartographier les régions promotrices et enhancer
• Étudier l’activité des facteurs de transcription
• Mesurer l’activation des voies de signalisation (par exemple, NF-κB, CREB, STAT)
• Cribler des composés qui modulent l’expression génique
• Surveiller l’activité des miARN (rapporteurs 3′ UTR)
• Quantifier l’efficacité de transfection