Aperçu
Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) mesure le transcriptome de cellules individuelles, offrant ainsi une résolution sans précédent de l’hétérogénéité cellulaire. L’ARN-seq en masse fait la moyenne de l’expression des gènes dans des millions de cellules, masquant les états transcriptionnels distincts de différents types de cellules. En revanche, scRNA-seq capture le profil d’expression de chaque cellule séparément, permettant la découverte de populations cellulaires rares, la reconstruction des trajectoires de développement et la caractérisation des réponses spécifiques à un type de cellule. Depuis la première étude scRNA-seq en 2009, la technologie a progressé rapidement, avec des plateformes modernes profilant des dizaines de milliers de cellules en une seule expérience.
Méthodes
Le flux de travail scRNA-seq implique l’isolement cellulaire (à l’aide de plates-formes basées sur des gouttelettes telles que 10x Genomics Chromium, de la microfluidique comme Fluidigm C1 ou de méthodes basées sur des plaques), une transcription inverse avec des identifiants moléculaires uniques (UMI) pour éliminer les biais d’amplification et la préparation de la bibliothèque pour le séquençage. L’analyse bioinformatique procède par : contrôle qualité (filtrage des cellules par nombre de gènes, contenu mitochondrial et nombre d’UMI), normalisation (SCTransform, scran ou BASiCS), correction par lots (Harmony, CCA de Seurat ou scVI), réduction de dimensionnalité (PCA suivie d’une visualisation UMAP ou t-SNE), clustering (algorithmes de Louvain ou de Leiden) et expression différentielle entre grappes. L’annotation des types de cellules utilise des gènes marqueurs et des bases de données de référence.
### Candidatures
scRNA-seq a transformé plusieurs domaines. Il a créé des atlas cellulaires complets pour les organes humains, cartographié l’embryon en développement et révélé des sous-types de cellules jusqu’alors inconnus dans le cerveau et le système immunitaire. Dans la recherche sur le cancer, scRNA-seq dissèque l’hétérogénéité tumorale et le microenvironnement tumoral, identifiant des marqueurs rares résistants aux médicaments états cellulaires liés à la cytométrie en flux. La technique s’appuie sur les principes fondamentaux du séquençage de l’ARN et des concepts de puces à ADN et expression génique. Les méthodes émergentes de transcriptomique spatiale ajoutent désormais un contexte positionnel aux données unicellulaires, révélant ainsi la manière dont les cellules s’organisent au sein des tissus.
Protocole pratique
Une expérience typique de scRNA-seq 10x Genomics commence par la préparation d’une suspension unicellulaire à une concentration de 700 à 1 200 cellules/µL avec une viabilité supérieure à 90 %. Le contrôleur de chrome divise les cellules en émulsions de billes de gel (GEM) à l’échelle nanolitre, chacune contenant une perle à code-barres avec des codes-barres 10x uniques et des UMI. Après transcription inverse dans les GEM, l’ADNc codé à barres est regroupé et amplifié. La construction de la bibliothèque implique la fragmentation enzymatique, la réparation des extrémités, la queue A, la ligature de l’adaptateur et la PCR d’index d’échantillon. Le séquençage est effectué sur une plateforme Illumina avec une configuration de lecture de R1 28 cycles (code-barres 10x et UMI), R2 91 cycles (insertion d’ADNc) et i7 index 8 cycles. Le pipeline Cell Ranger traite les fichiers BCL bruts en FASTQ à l’aide de « cellranger mkfastq », puis aligne les lectures sur le génome de référence avec STAR via « cellranger count ». La sortie comprend des matrices de codes-barres de fonctionnalités filtrées, des intégrations UMAP et des résultats de clustering. L’analyse en aval dans R utilise Seurat : CreateSeuratObject, SCTransform pour la normalisation, RunPCA et RunUMAP pour la réduction de dimensionnalité, et FindClusters avec l’algorithme de Leiden. En Python, Scanpy fournit des fonctions analogues : sc.pp.filter_cells, sc.pp.normalize_total, sc.pp.log1p, sc.tl.pca et sc.tl.leiden. La détection des doublets avec « DoubletFinder » ou « Scrublet » est recommandée avant le clustering, et l’intégration par lots entre les échantillons peut être effectuée avec « Harmony » ou « scVI ».
