Le spectrophotomètre est l’instrument le plus courant dans tout laboratoire. Il mesure la quantité de lumière qu’un échantillon absorbe à une longueur d’onde donnée, qui est proportionnelle à la concentration de l’espèce absorbante.

La Loi de Beer–Lambert

La relation fondamentale est :

A = ε × b × c

où A est l’absorbance (sans unité), ε est l’absorptivité molaire (L·mol⁻¹·cm⁻¹), b est le trajet optique (cm), et c est la concentration (mol/L). La loi est valable pour les solutions diluées (généralement A < 1,5). À des concentrations plus élevées, des déviations se produisent en raison des interactions moléculaires et de la lumière parasite instrumentale.

Composants de l’Instrument

• Source lumineuse : lampe au deutérium pour l’UV (190–350 nm), lampe tungstène-halogène pour le visible (350–900 nm). Les lampes au xénon sont utilisées dans certains instruments modernes.
• Monochromateur : un réseau ou un prisme qui sélectionne une bande étroite de longueurs d’onde. La largeur de bande affecte la qualité de mesure — une largeur de bande plus étroite donne une meilleure linéarité.
• Compartiment échantillon : contient la cuve. La plupart des instruments acceptent des cuves de 1 cm de trajet optique. Les cuves sont en quartz (pour l’UV) ou en verre/plastique (pour le visible uniquement).
• Détecteur : un tube photomultiplicateur ou une photodiode qui convertit la lumière transmise en un signal électrique.

Étapes de Fonctionnement

1. Allumez l’instrument et laissez la source lumineuse chauffer (15–30 minutes pour les lampes au deutérium).
2. Sélectionnez la longueur d’onde de mesure.
3. Remplissez une cuve avec la solution de blanc (le solvant sans analyte).
4. Placez le blanc dans le porte-échantillon et réglez l’absorbance à zéro (autozéro).
5. Mesurez l’échantillon et enregistrez l’absorbance.
6. Pour plusieurs échantillons, refaites le zéro avec le blanc périodiquement.

Manipulation des Cuyes

Manipulez les cuves par les côtés givrés ou striés — les empreintes digitales sur les fenêtres optiques diffusent la lumière et augmentent l’absorbance. Rincez les cuves avec la solution d’échantillon avant de remplir. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le trajet lumineux.

Applications Courantes

• Quantification des acides nucléiques : mesure à A₂₆₀ (1 DO₂₆₀ ≈ 50 µg/mL d’ADNdb, 40 µg/mL d’ARN, 33 µg/mL d’ADNsb). Pureté évaluée par le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ (≈1,8 pour l’ADN pur, ≈2,0 pour l’ARN pur).
• Quantification des protéines : les dosages Bradford, BCA et Lowry utilisent tous la spectrophotométrie visible.
• Cinétique enzymatique : suivi continu de la consommation de NADH à 340 nm ou de la formation de produit à une longueur d’onde spécifique.
• Courbes de croissance bactérienne : turbidité mesurée à 600 nm (DO₆₀₀).
• Dosages chimiques colorimétriques : presque n’importe quel analyte peut être mesuré s’il réagit pour former un produit coloré.