Avant que CRISPR/Cas9 ne devienne la plateforme dominante d’édition génomique, les TALENs et les ZFN étaient les principaux outils de modification génomique ciblée. Tous deux utilisent un domaine de liaison à l’ADN modulaire fusionné au domaine endonucléase de FokI.

Nucléases à Doigts de Zinc

Une ZFN est constituée de 3–6 modules doigts de zinc, chacun reconnaissant 3–4 pb d’ADN. Deux monomères de ZFN se lient à des sites adjacents avec un espaceur de 5–7 pb entre eux. FokI doit dimériser pour couper l’ADN, donc seul le complexe ZFN-FokI apparié crée une cassure double brin.

Les modules doigts de zinc ne sont pas vraiment modulaires : la spécificité de chaque doigt est influencée par ses voisins, ce qui rend la conception des ZFN difficile. La plupart des ZFN doivent être sélectionnées dans de grandes banques combinatories ou conçues à l’aide de plateformes propriétaires (Sangamo Biosciences). Cette complexité a limité l’adoption des ZFN malgré leur succès dans les premiers essais thérapeutiques (SB-728-T pour le VIH, phase 1).

TALENs

Les TALENs utilisent le domaine de liaison à l’ADN des effecteurs TAL de la bactérie Xanthomonas. Chaque répétition TAL reconnaît un seul nucléotide grâce à deux résidus d’acides aminés hypervariables (le dirésidu variable de répétition, RVD). Le code est simple et prévisible :

• HD → C
• NG → T
• NI → A
• NN → G ou A
• NH → G (spécificité plus élevée)

Un réseau TALEN typique a 12–20 répétitions ciblant une séquence de 12–20 pb. Comme les ZFN, les TALENs sont utilisés en paire flanquant un espaceur de 12–20 pb, avec les domaines FokI se dimérisant à travers l’espaceur.

L’assemblage des TALEN est modulaire, chaque répétition est une pièce standardisée, et des méthodes comme le clonage Golden Gate (MoClo, Golden TALEN, FLASH) permettent l’assemblage de réseaux TALEN à partir de modules de répétition préfabriqués.

Comparaison avec CRISPR/Cas9

Les TALENs offrent le taux d’effets hors cible le plus bas des trois plateformes car le site cible est plus long et chaque répétition TAL se lie à un seul nucléotide. Cependant, la grande taille de chaque monomère TALEN (~3 kb) rend leur livraison dans les vecteurs AAV difficile. Les ZFN sont suffisamment petites pour l’encapsidation AAV mais sont difficiles à concevoir en interne.

Applications

Les ZFN et les TALENs sont encore utilisés dans les applications où les coupures hors cible doivent être absolument minimisées (par exemple, l’édition thérapeutique dans les cellules souches) ou lorsque les exigences de PAM de CRISPR sont restrictives. Les TALENs n’ont pas d’exigence de PAM et peuvent cibler n’importe quelle séquence, y compris les séquences dépourvues de PAM NGG.