Aperçu
L’appel de variantes est le processus informatique consistant à identifier les différences entre le génome d’un individu et un génome de référence. Ces différences vont des polymorphismes mononucléotidiques (SNP) et de petites insertions ou délétions (indels) à de grandes variantes structurelles telles que des changements de nombre de copies et des réarrangements chromosomiques. La détection précise des variantes est la pierre angulaire de la génétique humaine, de la médecine de précision et de la biologie évolutive. Le processus nécessite une modélisation statistique minutieuse pour distinguer les véritables variations biologiques des erreurs de séquençage et des artefacts d’alignement.
Concepts clés
La plupart des appelants de variantes suivent un flux de travail commun : les lectures de séquençage sont d’abord alignées sur un génome de référence à l’aide d’outils tels que BWA ou Bowtie2, puis les données alignées sont traitées pour identifier les positions où la séquence de l’individu diffère de la référence. Le pipeline de bonnes pratiques boîte à outils d’analyse du génome (GATK) est largement adopté, utilisant une approche bayésienne pour calculer les probabilités des génotypes. Les principales considérations incluent la profondeur de couverture (une profondeur plus élevée améliore la confiance), les scores de qualité de base et la qualité de la cartographie. Le filtrage des variantes à l’aide de seuils stricts ou de l’apprentissage automatique (par exemple, VQSR) supprime les faux positifs. La détection de variantes structurelles nécessite des outils spécialisés tels que DELLY ou Manta qui analysent les paires de lectures discordantes et les lectures fractionnées.
### Candidatures
L’appel aux variantes est à la base de la génomique clinique et de la recherche. Il identifie les mutations sous-jacentes aux maladies génétiques rares et éclaire la génomique du cancer en révélant des mutations somatiques dans des comparaisons tumeur-normale. Des projets à l’échelle de la population tels que le projet 1000 Genomes ont catalogué des millions de variantes pour cartographier la diversité humaine. Dans les maladies infectieuses, l’appel de variantes suit l’évolution des agents pathogènes et la résistance aux médicaments. L’exactitude des appels de variantes dépend fondamentalement de la qualité des données de séquençage de nouvelle génération et de la plateforme de séquençage d’ADN utilisée.
Protocole pratique
Le flux de travail des meilleures pratiques GATK pour la découverte de variantes germinales courtes se déroule en plusieurs étapes. Commencez par les fichiers BAM alignés de BWA-MEM : bwa mem -t 8 -R "@RG\tID:sample\tSM:sample\tLB:lib\tPL:ILLUMINA" reference.fa sample_R1.fastq sample_R2.fastq > aligné.sam. Triez et convertissez en BAM avec samtools sort. Marquez les doublons à l’aide de « GATK MarkDuplicates » pour signaler les doublons PCR, puis indexez avec « samtools index ». Le recalibrage du score de qualité de base (BQSR) corrige les erreurs systématiques dans les qualités de base : construisez d’abord un modèle de recalibrage avec Gatk BaseRecalibrator -R reference.fa -I dedup.bam --known-sites dbsnp.vcf -O recal.table, puis appliquez-le avec Gatk ApplyBQSR -R reference.fa -I dedup.bam --bqsr-recal-file recal.table -O recal.bam. L’appel de variantes sur des échantillons individuels utilise Gatk HaplotypeCaller -R reference.fa -I recal.bam -O sample.g.vcf -ERC GVCF, produisant un gVCF pour le génotypage conjoint. Agrégez les échantillons avec Gatk GenomicsDBImport et appelez conjointement avec Gatk GenotypeGVCFs -R reference.fa -V cohort.g.vcf -O raw_variants.vcf. Le filtrage des variantes utilise le recalibrage du score de qualité des variantes (VQSR) : « Gatk VariantRecalibrator » construit un modèle de mélange gaussien en utilisant des sites de vérité connus (HapMap, Omni, 1000G), et « Gatk ApplyVQSR » applique un filtre de tranche (généralement une sensibilité de 99,0 % pour les SNP, 99,5 % pour les indels). Pour la détection des variantes structurelles, exécutez « Manta » avec son script de configuration suivi de l’exécution du workflow. Évaluez les ensembles d’appels finaux avec « Gatk CollectVariantCallingMetrics » et vérifiez le rapport transition/transversion : un Ti/Tv d’environ 2,0 à 2,1 indique une haute qualité pour les données sur le génome entier humain.
