La zymographie est une technique électrophorétique qui détecte l’activité enzymatique des protéases, lipases, glycosidases et autres enzymes hydrolytiques. L’application la plus courante est la détection de l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) dans les échantillons biologiques.

Principe

Un échantillon protéique est séparé par SDS-PAGE dans des conditions non réductrices (pas de DTT ni de β-mercaptoéthanol, ceux-ci détruiraient l’activité enzymatique). Le gel de séparation est copolymérisé avec un substrat, généralement de la gélatine (0,1 % p/v) pour la détection de MMP-2 et MMP-9, ou de la caséine pour une détection plus large des protéases. Après électrophorèse, le SDS est éliminé par lavage dans une solution de Triton X-100, permettant aux protéases de se renaturer. Le gel est ensuite incubé dans un tampon de développement à 37 °C pendant 12–48 heures, pendant lequel les protéases actives digèrent le substrat dans leur voisinage immédiat. Après coloration au Bleu de Coomassie, des bandes claires apparaissent sur un fond bleu foncé là où le substrat a été digéré.

Protocole

1. Préparez le gel de séparation avec 0,1 % de gélatine ou de caséine ajoutée à la solution d’acrylamide (8–10 % d’acrylamide est standard pour les MMP). Incluez un gel de concentration sans substrat.
2. Chargez les échantillons sans les bouillir et sans agents réducteurs. Utilisez un tampon d’échantillon non réducteur (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, glycérol 25 %, SDS 2 %, bleu de bromophénol 0,01 %).
3. Migrez à 100–150 V à 4 °C pour éviter la protéolyse pendant l’électrophorèse.
4. Lavez le gel dans un tampon de renaturation (Triton X-100 à 2,5 % dans Tris-HCl 50 mM pH 7,5) pendant 2 × 30 minutes à température ambiante avec agitation douce.
5. Lavez brièvement dans le tampon de développement (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, CaCl₂ 10 mM, NaCl 150 mM, NaN₃ 0,02 %, ZnCl₂ 1 µM).
6. Incubez dans le tampon de développement à 37 °C pendant 12–48 heures.
7. Colorez avec du Bleu de Coomassie R-250 (0,5 % dans méthanol 30 %, acide acétique 10 %) pendant 1 heure.
8. Décolorez (méthanol 30 %, acide acétique 10 %) jusqu’à ce que les bandes claires soient visibles.
9. Imagez le gel et quantifiez les bandes par densitométrie.

Interprétation

Les bandes apparaissent comme des zones claires sur un fond bleu. Leur position indique le poids moléculaire (par comparaison avec des standards protéiques), et leur intensité est proportionnelle à la quantité d’enzyme active. Le poids moléculaire de la bande claire doit correspondre à la forme pro ou active de la protéase attendue. Par exemple, la pro-MMP-9 apparaît à ~92 kDa, la MMP-9 active à ~82 kDa, la pro-MMP-2 à ~72 kDa et la MMP-2 active à ~62 kDa.

Zymographie Inverse

Pour détecter les inhibiteurs de protéases (TIMP, inhibiteurs tissulaires des métalloprotéinases), le gel est copolymérisé avec à la fois le substrat et une protéase standard (par exemple, milieu conditionné de cellules HT-1080 contenant des MMP actives). Après développement et coloration, les bandes d’inhibiteur apparaissent comme des zones sombres (colorées) là où le substrat n’a pas été digéré, sur un fond clair là où la protéase ajoutée a digéré le substrat partout ailleurs.

Applications

La zymographie est utilisée pour mesurer l’activité des MMP dans les extraits tumoraux, le liquide de plaie, le liquide synovial et les surnageants de culture cellulaire. C’est un dosage standard en biologie du cancer (les MMP favorisent l’invasion et la métastase), en maladies cardiovasculaires (remodelage de la plaque) et en remodelage tissulaire. La zymographie quantitative est possible avec des standards MMP purifiés chargés sur le même gel.

Limitations

La zymographie détecte l’activité protéolytique totale à ce poids moléculaire, pas nécessairement une seule enzyme, plusieurs protéases peuvent co-migrer. Elle n’est pas non plus vraiment quantitative dans un sens absolu (la cinétique de digestion du substrat varie entre les enzymes). Pour des mesures d’activité spécifiques, les dosages d’activité basés sur ELISA ou les dosages de clivage de substrat FRET sont préférés.