Dosages de l’Apoptose
L’apoptose (mort cellulaire programmée) est caractérisée par des changements morphologiques et biochimiques spécifiques. Plusieurs dosages complémentaires distinguent l’apoptose de la nécrose et identifient le stade de la mort cellulaire.
Coloration à l’Annexine V / Iodure de Propidium est le dosage d’apoptose par cytométrie en flux le plus courant. Pendant l’apoptose précoce, la phosphatidylsérine (PS) est transloquée du feuillet interne au feuillet externe de la membrane plasmique. L’Annexine V, une protéine liant la PS conjuguée à un fluorophore (FITC, APC, PE), se lie à la PS exposée. L’iodure de propidium (IP) ou le 7-AAD pénètre uniquement dans les cellules à membrane compromise (apoptose tardive/nécrose).
- Annexine V⁻ / IP⁻ : cellules vivantes
- Annexine V⁺ / IP⁻ : cellules en apoptose précoce
- Annexine V⁺ / IP⁺ : cellules en apoptose tardive / nécrose
Dosage TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) détecte la fragmentation de l’ADN, une caractéristique de l’apoptose tardive. La désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) ajoute du dUTP marqué aux extrémités 3′-OH de l’ADN fragmenté. La détection se fait par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux.
Dosages des caspases mesurent l’activité des caspases, les protéases exécutrices de l’apoptose. Les substrats fluorogéniques (par exemple, DEVD-AMC pour la caspase-3/7) sont clivés par les caspases actives, libérant un signal fluorescent. L’activité de la caspase-3/7 est le marqueur biochimique de l’apoptose le plus utilisé.
Analyse du Cycle Cellulaire
L’analyse du cycle cellulaire mesure la distribution des cellules dans les phases G₀/G₁, S, G₂ et M, révélant les effets des médicaments, des nutriments ou des changements génétiques sur la division cellulaire.
Analyse du contenu en ADN par cytométrie en flux utilise un colorant fluorescent se liant à l’ADN (IP, DAPI, Hoechst 33342). Les cellules fixées et perméabilisées sont colorées et l’intensité de fluorescence est mesurée. L’intensité est proportionnelle au contenu en ADN :
- G₀/G₁ : contenu en ADN 2N (un pic)
- S : entre 2N et 4N (la région entre les pics)
- G₂/M : contenu en ADN 4N (deuxième pic)
Le pourcentage de cellules dans chaque phase est calculé à l’aide de logiciels de modélisation (ModFit, algorithme Watson de FlowJo).
Pulse-chasse BrdU/EdU fournit des informations plus détaillées sur le cycle cellulaire. Une courte impulsion de BrdU ou d’EdU marque les cellules en phase S. Après une période de chasse, les cellules sont analysées pour le contenu en ADN et l’incorporation de BrdU/EdU, révélant le taux de progression en phase S et la durée de chaque phase.
Coloration de la phospho-histone H3 (Ser10) marque spécifiquement les cellules mitotiques, fournissant un marqueur de phase G₂/M qui distingue G₂ de M par cytométrie en flux ou microscopie.
