Après avoir isolé une culture pure, l’étape suivante est l’identification. Les tests biochimiques traditionnels évaluent les capacités métaboliques, tandis que les systèmes automatisés modernes accélèrent et standardisent le processus.

Tests Biochimiques Fondamentaux

• Catalase : détecte l’enzyme catalase, qui décompose le peroxyde d’hydrogène. Une goutte de H₂O₂ à 3 % sur une colonie produit des bulles (positif) en quelques secondes. Les staphylocoques sont catalase-positifs ; les streptocoques sont catalase-négatifs.
• Oxydase : détecte le cytochrome c oxydase. Une colonie étalée sur un papier filtre imprégné de réactif oxydase (tétraméthyl-p-phénylènediamine) devient pourpre foncé en 10–30 secondes (positif). Neisseria et Pseudomonas sont oxydase-positifs ; les Enterobacteriaceae sont oxydase-négatifs.
• Coagulase : distingue Staphylococcus aureus (positif) des autres staphylocoques. La coagulase libre est détectée en mélangeant une colonie avec du plasma de lapin et en vérifiant la formation de caillot à 4–24 heures.
• Indole : certaines bactéries (E. coli entre autres) produisent de l’indole à partir du tryptophane. L’indole réagit avec le réactif de Kovac (p-diméthylaminobenzaldéhyde) pour produire une couche rouge.
• Rouge de méthyle / Voges–Proskauer (RM/VP) : RM détecte la fermentation acide mixte (rouge avec l’indicateur rouge de méthyle). VP détecte la voie de fermentation du butanediol (rose/rouge avec α-naphtol et KOH). Classique pour E. coli (RM⁺, VP⁻) vs. Enterobacter / Klebsiella (RM⁻, VP⁺).
• Utilisation du citrate : les bactéries qui utilisent le citrate comme seule source de carbone produisent de l’ammoniac, élevant le pH et faisant passer le bleu de bromothymol du vert au bleu. Klebsiella pneumoniae est positive ; E. coli est négative.
• Gélose TSI (Triple Sugar Iron) : une pente qui détecte la fermentation du glucose, du lactose et du saccharose, la production de gaz et la production de H₂S. Le profil des réactions acide/alcaline et du précipité noir est caractéristique des entérobactéries.

Systèmes Miniaturisés (Galeries API)

Le système API (Analytical Profile Index) miniaturise 20–50 tests biochimiques dans une bandelette en plastique. Chaque test est un substrat déshydraté dans une cupule. La bandelette est inoculée avec une suspension bactérienne standardisée, incubée pendant 18–24 heures, et les réactions sont lues en fonction des changements de couleur. Le numéro de profil à 7 ou 9 chiffres résultant est recherché dans une base de données pour identifier l’organisme.

Systèmes Automatisés

• VITEK (bioMérieux) : utilise des cartes en plastique contenant 30–60 réactions biochimiques. Une suspension bactérienne est chargée dans la carte, qui est scellée et lue automatiquement toutes les 15 minutes. L’identification est générée en 2–8 heures. Le VITEK 2 fournit également des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST).
• MALDI-TOF MS (Spectrométrie de Masse à Désorption/Ionisation Laser Assistée par Matrice avec Analyseur à Temps de Vol) : la méthode d’identification la plus rapide disponible. Une colonie bactérienne est déposée sur une plaque cible, recouverte d’une matrice (acide α-cyano-4-hydroxycinnamique) et analysée par spectrométrie de masse. Le spectre protéique résultant (principalement des protéines ribosomiques) est comparé à une base de données, fournissant une identification au niveau de l’espèce en moins d’une minute par échantillon.

Le MALDI-TOF a largement remplacé les tests biochimiques dans les laboratoires de microbiologie clinique en raison de sa rapidité, de sa précision et de son faible coût consommable après acquisition de l’instrument. Il identifie les bactéries, les levures et les champignons à partir d’une seule colonie sans nécessiter de connaissance préalable de l’organisme.