La coloration de Gram différencie les bactéries par la structure de leur paroi cellulaire, mais de nombreuses caractéristiques bactériennes nécessitent des méthodes de coloration spécialisées pour la visualisation microscopique.

Coloration des Endospores (Schaeffer–Fulton)

Les endospores bactériennes (Bacillus, Clostridium) sont des structures dormantes hautement résistantes qui ne se colorent pas avec les colorations simples ou de Gram. La méthode de Schaeffer–Fulton utilise le vert de malachite, qui est poussé dans la spore par la chaleur (vapeur), et la safranine comme contre-colorant.

1. Recouvrez le frottis de vert de malachite à 5 % (p/v) et faites chauffer à la vapeur pendant 5 minutes (maintenez la lame humide en ajoutant plus de colorant).
2. Refroidissez et rincez à l’eau (le vert de malachite est piégé dans la spore mais se lave des cellules végétatives).
3. Contre-colorez avec de la safranine à 0,5 % pendant 30 secondes.
4. Rincez, séchez et examinez.

Les spores apparaissent vertes (souvent comme des corps ovales ou sphériques à l’intérieur ou libérés des cellules végétatives roses/rouges). La position de la spore (terminale, subterminale, centrale) est une caractéristique d’identification clé.

Coloration de la Capsule

Les capsules sont des couches de polysaccharides ou de polypeptides qui entourent certaines bactéries, les protégeant de la phagocytose et de la dessiccation. Les capsules sont hydrosolubles et facilement perturbées par la fixation à la chaleur.

Méthode d’Anthony : le frottis est séché à l’air (pas fixé à la chaleur !), coloré avec du violet cristal à 1 % pendant 2 minutes, puis lavé avec du sulfate de cuivre à 20 %. Le sulfate de cuivre agit comme décolorant et mordant. La capsule apparaît comme un halo violet pâle autour d’une cellule pourpre foncé sur un fond clair.

Coloration négative à l’encre de Chine : mélangez la suspension bactérienne avec de l’encre de Chine, étalez finement et séchez à l’air. Les particules d’encre ne peuvent pas pénétrer la capsule, laissant un halo clair autour de la cellule sur un fond sombre. L’éosine ou la nigrosine peuvent être utilisées à la place de l’encre de Chine.

Coloration des Flagelles

Les flagelles bactériens ont une épaisseur de 10–20 nm — en dessous de la résolution de la microscopie optique. Les colorations des flagelles utilisent un mordant (acide tannique) pour enrober et épaissir les flagelles, suivies d’une coloration à l’argent ou d’un colorant à la pararosaniline.

1. Utilisez une jeune culture (phase logarithmique) cultivée sur milieu solide.
2. Préparez un frottis mince séché à l’air — ne fixez pas à la chaleur.
3. Appliquez le mordant (par exemple, coloration de Leifson : acide tannique, fuchsine basique, chlorure de sodium) et incubez.
4. Les flagelles apparaissent comme des fils fins et ondulés s’étendant du corps cellulaire.

La disposition des flagelles (polaire, péritriche, lophotriche) est une caractéristique taxonomique importante.

Coloration Acido-Alcoolo-Résistante (Ziehl–Neelsen)

Les espèces de Mycobacterium (tuberculose, lèpre) ont une paroi cellulaire cireuse riche en acides mycoliques qui résiste à la coloration de Gram standard. La méthode de Ziehl–Neelsen utilise la chaleur pour faire pénétrer la carbolfuchsine à travers la barrière cireuse :

1. Recouvrez le frottis de carbolfuchsine et faites chauffer à la vapeur pendant 5 minutes.
2. Décolorez avec du HCl à 3 % dans de l’éthanol à 95 % (acide-alcool) — les bactéries non acido-alcoolo-résistantes perdent la coloration.
3. Contre-colorez avec du bleu de méthylène pendant 1 minute.

Les bactéries acido-alcoolo-résistantes apparaissent rouge vif sur un fond bleu. La méthode de Kinyoun utilise une concentration plus élevée de phénol et un détergent dans la carbolfuchsine, éliminant le besoin de chauffage. La coloration à l’auramine–rhodamine utilise des colorants fluorescents pour une sensibilité plus élevée dans le dépistage de la tuberculose.