La transformation est l’absorption et la réplication d’ADN étranger par des cellules bactériennes. La plupart des souches de laboratoire d’Escherichia coli ne sont pas naturellement compétentes — elles doivent être induites artificiellement pour absorber l’ADN.

Préparation de Cellules Compétentes

Cellules chimio-compétentes sont préparées en lavant des E. coli en phase logarithmique avec du CaCl₂ glacé (50–100 mM). Les ions calcium neutralisent le squelette phosphate chargé négativement de l’ADN et la couche de lipopolysaccharides de la membrane externe bactérienne, facilitant la liaison de l’ADN. Les cellules sont aliquotées et congelées à −80 °C.

Cellules électrocompétentes sont lavées plusieurs fois dans du glycérol à 10% glacé pour éliminer tous les ions de la suspension. La faible force ionique empêche la formation d’arcs électriques pendant l’électroporation. Les cellules sont resuspendues dans un petit volume de glycérol à 10%, aliquotées et congelées.

Protocole de Transformation Chimique

1. Décongeler un tube de cellules chimio-compétentes sur glace (environ 20 minutes).
2. Ajouter 1–10 µL d’ADN (0,1–100 ng de plasmide, ou jusqu’à 5 µL d’une réaction de ligation).
3. Incuber sur glace pendant 20–30 minutes.
4. Choc thermique à 42 °C pendant exactement 45 secondes — plus longtemps réduit la viabilité.
5. Remettre sur glace pendant 2 minutes.
6. Ajouter 500–900 µL de milieu SOC ou LB (sans antibiotique).
7. Incuber à 37 °C sous agitation à 200–225 rpm pendant 45–60 minutes.
8. Étaler 50–200 µL sur des boîtes de gélose sélective.
9. Incuber inversées toute la nuit à 37 °C.

Efficacité typique : 10⁶–10⁸ UFC/µg pour les cellules chimio-compétentes.

Protocole d’Électroporation

1. Décongeler des cellules électrocompétentes sur glace.
2. Transférer les cellules dans une cuve réfrigérée de 0,1 ou 0,2 cm.
3. Ajouter 1–2 µL d’ADN dans un tampon à faible teneur en sel ou dans l’eau (le sel provoque des arcs).
4. Électroporer à 1,5–2,5 kV (selon l’écartement de la cuve), 200–400 Ω, 25 µF.
5. Ajouter immédiatement 500 µL de milieu SOC et resuspendre.
6. Transférer dans un tube de culture et incuber à 37 °C pendant 45–60 minutes.
7. Étaler sur gélose sélective.

Efficacité typique : 10⁹–10¹⁰ UFC/µg pour les petits plasmides. L’électroporation est préférée pour les grandes constructions (>10 kb) et les produits de ligation.

Sélection

Les cellules transformées sont sélectionnées sur gélose contenant un antibiotique correspondant au marqueur de résistance du plasmide. Antibiotiques courants : ampicilline (100 µg/mL), kanamycine (50 µg/mL), chloramphénicol (25 µg/mL), tétracycline (12,5 µg/mL). La sélection à l’ampicilline nécessite des boîtes fraîches car la β-lactamase diffuse et dégrade l’antibiotique — des colonies satellites apparaissent sur les vieilles boîtes.