L’électrophorèse capillaire (EC) est une famille de méthodes de séparation électrocinétiques réalisées dans des capillaires étroits en silice fondue dont les diamètres internes sont compris entre 25 et 100 micromètres. Un champ électrique de 100 à 500 V/cm est appliqué à travers le capillaire, entraînant les analystes chargés vers l’électrode opposée à des vitesses déterminées par leur mobilité électrophorétique. L’EC combine une efficacité de séparation élevée (dépassant souvent 100 000 plateaux théoriques) avec des temps d’analyse courts, une consommation d’échantillon minimale (nanolitres) et une compatibilité avec les tampons aqueux et non aqueux. Elle est devenue une plateforme essentielle dans l’analyse pharmaceutique, le diagnostic clinique, la science forensique, la protéomique et la métabolomique, offrant un mécanisme de séparation orthogonal à la fois à la chromatographie liquide et à l’électrophorèse sur gel.
Le Principe de la Mobilité Électrophorétique
Lorsqu’un champ électrique est appliqué à une solution, une particule chargée subit une force électrostatique proportionnelle à sa charge nette (q) et à l’intensité du champ (E). La particule accélère jusqu’à ce que la force de traînée du milieu environnant égale la force électrostatique, après quoi elle migre à une vitesse constante. La mobilité électrophorétique (µ_ep) est définie comme la vitesse par unité d’intensité de champ et est proportionnelle à q divisé par le rayon hydrodynamique (r) de la particule. Les ions petits et hautement chargés ont une mobilité élevée, tandis que les espèces volumineuses ou faiblement chargées migrent plus lentement. Cette migration différentielle est le fondement de toutes les séparations électrophorétiques.
Flux Électroosmotique
Le flux électroosmotique (FEO) est un phénomène distinctif en EC qui provient de la double couche électrique à la paroi du capillaire en silice fondue. À un pH supérieur à environ 3, les groupes silanol à la surface interne du capillaire sont déprotonés, créant une paroi chargée négativement. Les cations du tampon s’accumulent près de la paroi pour former une double couche électrique diffuse. Lorsque le champ électrique est appliqué, ces cations hydratés migrent vers la cathode, entraînant avec eux la solution totale. Le profil FEO résultant est presque plat (en forme de bouchon), contrairement au profil d’écoulement parabolique des systèmes entraînés par pression tels que la HPLC. Cet écoulement bouchon minimise l’élargissement des zones, contribuant aux efficacités de séparation exceptionnellement élevées observées en EC. L’ampleur et la direction du FEO dépendent du pH du tampon, de la force ionique et de la chimie de la paroi capillaire, et peuvent être supprimées ou inversées par des revêtements de paroi ou des modificateurs dynamiques.
Instrumentation
Un instrument d’EC se compose d’une alimentation haute tension (généralement 0 à 30 kV), de deux réservoirs de tampon avec des électrodes en platine, d’un capillaire en silice fondue (25 à 100 cm de longueur) et d’un détecteur. Le capillaire traverse le détecteur, permettant une détection sur colonne sans nécessiter de plomberie de dérivation post-colonne. L’introduction de l’échantillon est effectuée en remplaçant un réservoir de tampon par le flacon d’échantillon et en appliquant une pression (injection hydrodynamique) ou une tension (injection électrocinétique) pendant un temps défini. L’injection hydrodynamique est préférée pour le travail quantitatif car le volume introduit est indépendant de la matrice de l’échantillon, tandis que l’injection électrocinétique introduit un biais vers les analystes plus mobiles mais peut atteindre une sensibilité plus élevée pour les composants traces.
Modes de Détection
La détection par absorbance UV-Vis est la méthode de détection EC la plus courante, généralement réalisée à travers une fenêtre créée en retirant le revêtement en polyimide du capillaire. L’absorbance est mesurée à travers le diamètre du capillaire, ce qui limite la longueur du trajet optique au diamètre interne du capillaire (25 à 100 µm), résultant en une sensibilité modeste (bas micromolaire). La détection par fluorescence induite par laser (LIF) offre une sensibilité considérablement plus élevée (niveaux attomolaires à zeptomolaires) pour les analystes marqués par fluorescence, ce qui en fait la méthode de choix pour le séquençage d’ADN et l’analyse de traces. La détection électrochimique (ampérométrie et conductivité) est utilisée pour les espèces électroactives et les petits ions inorganiques. L’EC couplée à la spectrométrie de masse (EC-SM) par ionisation par électrospray offre à la fois une efficacité de séparation élevée et une identification structurale, et est largement employée en protéomique et métabolomique pour l’analyse des peptides, protéines et métabolites polaires.
Les Modes de Séparation
L’EC englobe plusieurs modes opérationnels qui exploitent différents mécanismes de séparation. L’électrophorèse capillaire de zone (ECZ) sépare les analystes en fonction de leur rapport charge/taille en solution libre et est le mode le plus utilisé. L’électrophorèse capillaire sur gel (ECG) utilise un gel polymère ou une matrice polymère linéaire pour séparer les molécules par taille, et est la plateforme standard pour le séquençage d’ADN et le profilage d’ADN forensique. Le focalisation isoélectrique capillaire (FIEC) sépare les molécules amphotères telles que les protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI) dans un gradient de pH. L’isotachophorèse capillaire (CITP) utilise un système de tampon discontinu pour concentrer les analystes en zones nettes et concentrées, et est souvent utilisée pour la préconcentration d’échantillons avant l’ECZ. La chromatographie électrocinétique micellaire (CEM) introduit des micelles de tensioactif comme phase pseudo-stationnaire, permettant la séparation d’analystes neutres par partition hydrophobe. Le choix du mode dépend de la nature des analystes et des objectifs de séparation.
Comparaison avec la HPLC
L’EC et la HPLC sont des techniques de séparation complémentaires. La HPLC sépare les analystes en fonction du partage entre une phase stationnaire et une phase mobile, tandis que l’EC sépare en fonction des différences de mobilité électrophorétique en solution libre. L’EC offre généralement un nombre de plateaux plus élevé (100 000 à 500 000 plateaux par mètre) que la HPLC, mais une sensibilité de concentration plus faible en raison de la courte longueur du trajet optique et des petits volumes d’injection. L’EC est particulièrement avantageuse pour les espèces chargées, polaires et ioniques qui peuvent être difficiles à retenir sur les colonnes HPLC en phase inverse. Le développement de méthodes en EC est simplifié par la large gamme de modes de séparation et la capacité de manipuler la sélectivité par la composition du tampon, le pH et les additifs sans avoir à changer de colonnes.
