L’isotachophorèse capillaire (CITP) est une technique de séparation électrophorétique spécialisée qui emploie un système de tampon discontinu composé d’un électrolyte de tête (LE) et d’un électrolyte de terminaison (TE) pour concentrer les analytes chargés en zones nettement définies et contiguës. Toutes les zones d’analytes migrent à la même vitesse, déterminée par l’ion de tête, une condition connue sous le nom d’état isotachophorétique. La CITP offre des capacités uniques de concentration, de purification et de préconcentration des échantillons avant l’analyse en aval, et est particulièrement précieuse pour l’enrichissement de traces d’analytes ioniques à partir d’échantillons dilués. Contrairement à l’électrophorèse de zone, où les analytes se séparent en zones discrètes qui s’élargissent avec le temps, l’isotachophorèse comprime et maintient des zones étroites tout au long de la séparation, produisant des concentrations locales élevées d’analytes qui améliorent la sensibilité de détection.
Le système de tampon discontinu
La condition fondamentale de l’isotachophorèse est l’utilisation de deux systèmes tampons qui partagent un contre-ion commun mais diffèrent par leur mobilité effective. L’électrolyte de tête contient un ion ayant la mobilité effective la plus élevée parmi toutes les espèces ioniques du système, tandis que l’électrolyte de terminaison contient un ion ayant la mobilité effective la plus faible. L’échantillon est introduit entre ces deux électrolytes. Lorsque le champ électrique est appliqué, l’ion de tête se déplace le plus rapidement et établit la vitesse de migration pour l’ensemble du système. Les ions de mobilités intermédiaires s’organisent par ordre décroissant de mobilité entre les zones de tête et de terminaison. Toutes les zones migrent alors à la même vitesse, régie par l’ion de tête, et restent en contact les unes avec les autres sans espace. La concentration de chaque analyte s’ajuste automatiquement selon la fonction de régulation de Kohlrausch, qui stipule que le produit de la concentration et de la mobilité est constant dans chaque zone en régime stationnaire.
Mécanisme de focalisation et affinement des zones
L’effet d’auto-affinement est la caractéristique déterminante de l’isotachophorèse. Si un ion analyte diffuse dans une zone voisine où le champ électrique est différent, il subit une force qui le ramène dans sa propre zone. Les ions qui s’égarent dans une zone de champ électrique plus élevé accélèrent jusqu’à ce qu’ils réintègrent leur zone correcte, tandis que ceux qui pénètrent dans une zone de champ plus faible décélèrent. Cette focalisation dynamique contrecarre la diffusion et produit des limites de zone exceptionnellement nettes. La concentration de l’analyte dans chaque zone est déterminée par la concentration et la mobilité de l’ion de tête, et non par la concentration initiale de l’échantillon. Cette propriété unique permet à la CITP de concentrer les analytes par des facteurs de 100 à 1000 ou plus, ce qui en fait un outil puissant pour l’analyse de traces.
Instrumentation et considérations pratiques
La CITP peut être réalisée dans le même équipement d’électrophorèse capillaire que celui utilisé pour d’autres modes de séparation, à condition que le système puisse prendre en charge la configuration de tampon discontinu. Un capillaire en silice fondue est rempli de l’électrolyte de tête, suivi de l’injection de l’échantillon, puis de l’introduction de l’électrolyte de terminaison dans le réservoir d’entrée. Une alimentation à courant constant est généralement préférée à un fonctionnement à tension constante car le courant reste stable pendant la séparation, tandis que la tension change à mesure que des zones de conductivité différente traversent le capillaire. La détection est généralement effectuée à l’aide de détecteurs de conductivité, qui répondent aux changements de conductivité de zone, ou de détecteurs d’absorbance UV-Vis positionnés à la sortie du capillaire. La formation de zones stables et reproductibles nécessite une sélection minutieuse de la composition des électrolytes de tête et de terminaison, y compris le choix du contre-ion, du pH et l’ajout d’agents complexants ou de solvants organiques pour ajuster la sélectivité.
Couplage avec l’électrophorèse capillaire de zone
L’une des applications les plus importantes de la CITP est en tant qu’étape de préconcentration en ligne avant l’électrophorèse capillaire de zone (CZE). Dans une configuration CITP-CZE couplée, le premier segment du capillaire est utilisé pour la focalisation isotachophorétique d’un grand volume d’échantillon, tandis que le second segment effectue la séparation par électrophorèse de zone des bandes d’analyte focalisées. Un commutateur de conductivité ou de tension est utilisé pour transférer les zones empilées de l’étape CITP à l’étape CZE. Cette approche peut améliorer la sensibilité de détection de deux à trois ordres de grandeur par rapport à l’injection CZE conventionnelle, permettant la détection de composants traces à des concentrations de l’ordre du nanomolaire. La technique hybride CITP-CZE a été appliquée à l’analyse de peptides, de protéines, de nucléotides, d’impuretés pharmaceutiques, de contaminants environnementaux et d’additifs alimentaires.
Applications en bioanalyse
La CITP a trouvé une utilisation extensive dans le domaine bioanalytique pour la préconcentration et la purification d’échantillons biologiques complexes. En protéomique, la CITP est employée pour concentrer les digestats protéiques dilués et éliminer les sels et tampons abondants qui interféreraient avec la détection par spectrométrie de masse. La technique a été intégrée aux flux de travail de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire (CE-MS) pour améliorer la détection des peptides de faible abondance et des modifications post-traductionnelles. En chimie clinique, la CITP est utilisée pour la détermination des acides organiques dans l’urine, le suivi des métabolites médicamenteux dans le plasma et le dépistage des erreurs innées du métabolisme. La capacité de traiter de grands volumes d’injection sans perte de résolution rend la CITP particulièrement adaptée aux échantillons où les analytes d’intérêt sont présents à l’état de traces dans une matrice complexe.
Tendances actuelles et orientations futures
Les développements récents de la CITP comprennent la miniaturisation sur puces microfluidiques, où la focalisation isotachophorétique est utilisée pour concentrer les analytes dans des réseaux de microcanaux en vue d’une intégration avec les dispositifs de laboratoire sur puce. Les progrès dans la conception des électrolytes, y compris l’utilisation de tampons zwitterioniques et de systèmes de solvants non aqueux, ont élargi la gamme d’analytes pouvant être soumis à une analyse isotachophorétique. La modélisation informatique du processus isotachophorétique permet désormais une optimisation rationnelle des compositions de tampons et des conditions de séparation. La CITP continue d’évoluer en tant que technique complémentaire au sein de la boîte à outils plus large de l’électrophorèse capillaire, appréciée pour son pouvoir concentrateur unique et sa capacité à traiter des matrices d’échantillons difficiles rencontrées dans la surveillance environnementale, la sécurité alimentaire, le développement pharmaceutique et le diagnostic clinique.
