L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) est le mode le plus fondamental et le plus largement utilisé de l’électrophorèse capillaire. En CZE, le capillaire est rempli d’un électrolyte de fond (BGE) continu et uniforme, et l’échantillon est introduit sous forme d’un bouchon étroit à l’extrémité d’entrée. Sous l’influence du champ électrique appliqué, chaque analyte migre avec sa vitesse caractéristique, déterminée par la somme de sa mobilité électrophorétique et du flux électroosmotique (EOF). Les analytes qui diffèrent par leur charge ou leur taille migrent à des vitesses différentes et sont séparés en zones distinctes lorsqu’ils se déplacent vers le détecteur. La CZE est appliquée à une large gamme de classes d’analytes, des petits ions inorganiques et produits pharmaceutiques aux peptides, protéines et fragments d’acides nucléiques.
Le Mécanisme de Séparation par Zone
La vitesse de migration nette d’un analyte en CZE est la somme vectorielle de sa vitesse électrophorétique (vers l’électrode de charge opposée) et de la vitesse électroosmotique (normalement vers la cathode). À un pH supérieur à 3, l’EOF est généralement plus fort que la mobilité électrophorétique de la plupart des anions, donc tous les analytes — cations, neutres et anions — sont entraînés vers le détecteur à l’extrémité cathodique. Les cations migrent le plus rapidement car leur migration électrophorétique est dans la même direction que l’EOF. Les analytes neutres migrent à la vitesse de l’EOF et co-éluent en un seul pic non résolu, c’est pourquoi la CZE ne convient pas aux espèces neutres sans modification. Les anions migrent le plus lentement car leur migration électrophorétique s’oppose à l’EOF, et ceux dont la mobilité est supérieure à l’EOF dans la direction opposée n’atteignent jamais le détecteur. La fenêtre de séparation est définie par le temps de migration d’un marqueur neutre (t_EOF) et le temps auquel l’anion le plus lent émerge.
Composition du Tampon et Sélectivité
Le choix du BGE est l’outil le plus puissant pour contrôler la sélectivité en CZE. Le pH du tampon détermine l’état d’ionisation des analytes acides et basiques et donc leur charge effective et leur mobilité. Pour les séparations de peptides et de protéines, le pH est ajusté à une valeur où les espèces d’intérêt ont des charges nettes significativement différentes, typiquement dans la plage de 2 à 9. La force ionique du tampon affecte à la fois l’amplitude de l’EOF et l’épaisseur de la double couche électrique ; une force ionique plus élevée réduit l’EOF et comprime la double couche, améliorant la résolution mais augmentant le courant et l’effet Joule. Des solvants organiques comme l’acétonitrile ou le méthanol peuvent être ajoutés au BGE pour modifier la solubilité des analytes, changer la constante diélectrique et modifier l’EOF. Les séparations chirales sont obtenues en ajoutant des cyclodextrines ou d’autres sélecteurs chiraux au BGE, qui forment des complexes diastéréomériques transitoires avec les énantiomères.
Plateaux Théoriques et Résolution
Les séparations par CZE se caractérisent par des nombres de plateaux extrêmement élevés, dépassant souvent 200 000 plateaux par mètre. L’élargissement des zones en CZE est dominé par la diffusion longitudinale, car le profil plat de l’EOF élimine l’élargissement induit par l’écoulement qui limite l’efficacité de la HPLC. Le nombre de plateaux théoriques (N) est donné par N = (µ_app V) / (2 D), où µ_app est la mobilité apparente, V est la tension appliquée et D est le coefficient de diffusion. La résolution entre deux pics dépend de la différence de leurs mobilités apparentes, du nombre moyen de plateaux et de la vitesse électroosmotique. La résolution peut être améliorée en augmentant la tension appliquée (jusqu’à la limite de l’effet Joule), en allongeant la longueur effective du capillaire, en réduisant l’EOF (en abaissant le pH ou en utilisant des capillaires revêtus) ou en optimisant la composition du tampon pour maximiser la différence de mobilité entre les analytes.
Concentration d’Échantillon par Stacking
La sensibilité de concentration de la CZE avec détection par absorbance UV est limitée par la courte longueur du trajet optique et le faible volume d’injection (typiquement 1 à 20 nL). Les techniques de préconcentration sur capillaire, connues collectivement sous le nom de stacking, améliorent considérablement la sensibilité en concentrant la zone d’échantillon avant le début de la séparation. Le stacking amplifié par champ (FASS) exploite la différence de conductivité entre la matrice de l’échantillon (faible conductivité) et le BGE (conductivité élevée). Lorsque la tension est appliquée, le champ électrique plus élevé dans la zone d’échantillon de faible conductivité fait migrer rapidement les ions de l’analyte jusqu’à ce qu’ils atteignent la limite du BGE, où ils ralentissent et s’accumulent en une bande étroite. Le balayage (sweeping) utilise des phases pseudo-stationnaires comme les micelles pour capturer et concentrer les analytes neutres ou chargés. L’isotachophorèse transitoire (tITP) utilise un système d’électrolyte principal et de terminaison pour concentrer les analytes en zones nettes, similaire à l’isotachophorèse capillaire, avant de passer à la séparation par CZE. Ces méthodes de stacking peuvent fournir une amélioration de sensibilité de 10 à 1000 fois, amenant les limites de détection UV dans la gamme nanomolaire inférieure.
Applications en Laboratoire Clinique
La CZE est largement utilisée dans les laboratoires cliniques pour l’analyse des protéines sériques, où elle a largement remplacé l’électrophorèse sur gel d’agarose pour l’électrophorèse des protéines sériques (SPEP) de routine. Les protéines sériques se séparent en cinq fractions principales — albumine, alpha-1, alpha-2, bêta et gamma globulines — et l’électrophérogramme est évalué pour les gammapathies monoclonales, les profils inflammatoires et les carences en protéines. La CZE est également la méthode de choix pour le dépistage des hémoglobinopathies, séparant les variants de l’hémoglobine tels que HbA, HbF, HbS et HbC à pH alcalin. Dans l’analyse pharmaceutique, la CZE est utilisée pour les tests de pureté des médicaments, la détermination des contre-ions et le profilage des impuretés chirales. En protéomique, la CZE couplée à la spectrométrie de masse (CZE-MS/MS) fournit une séparation peptidique de haute efficacité pour l’identification des protéines par approche bottom-up, particulièrement avantageuse pour les échantillons de faible volume et les peptides basiques qui sont difficiles à analyser par LC-MS en phase inverse.
Considérations sur le Développement de Méthodes
Le développement d’une méthode CZE commence par la sélection du pH du BGE en fonction des valeurs pKa des analytes. Un tampon phosphate ou borate à pH 2,5 est un point de départ courant pour les petites molécules et les peptides. Les dimensions du capillaire (longueur, diamètre intérieur) et la tension appliquée sont choisies pour équilibrer la vitesse d’analyse et la résolution. La température de la colonne est contrôlée par refroidissement à air forcé ou à liquide pour dissiper la chaleur Joule, et le capillaire est rincé entre les passages avec de l’hydroxyde de sodium, de l’eau et du BGE pour maintenir la reproductibilité. Pour l’analyse quantitative, un étalon interne est ajouté pour corriger la variabilité du volume d’injection, et la méthode est validée pour la linéarité, la précision, l’exactitude et la robustesse selon les directives de l’ICH.
