Savoir combien de cellules vivantes vous avez et à quelle vitesse elles se divisent est essentiel pour la culture cellulaire reproductible et les expériences pharmacologiques.

Comptage à l’Hémocytomètre

L’hémocytomètre est une lame de microscope spécialisée avec deux chambres de comptage gravées, chacune contenant une grille de dimensions connues. La grille se compose de neuf carrés de 1 × 1 mm, chacun subdivisé en 16 carrés plus petits. La profondeur est de 0,1 mm, donnant un volume de 0,1 µL par carré de 1 mm².

1. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire pour obtenir des cellules individuelles.
2. Mélangez 10 µL de suspension cellulaire avec 10 µL de bleu trypan à 0,4 % (pour la viabilité).
3. Chargez 10 µL du mélange dans la chambre de l’hémocytomètre.
4. Comptez les cellules dans les quatre carrés d’angle de 1 mm² (au moins 100 cellules au total pour une signification statistique).
5. Calculez : cellules/mL = (comptage moyen par carré) × facteur de dilution × 10⁴.

Exclusion au Bleu Trypan

Le bleu trypan est exclu par les cellules vivantes à membranes intactes mais pénètre dans les cellules mortes, les colorant en bleu. Viabilité = (cellules vivantes / cellules totales) × 100 %. Une viabilité acceptable pour la plupart des expériences est >90 %.

Compteurs Cellulaires Automatisés

Les compteurs automatisés (Countess, Vi-CELL, Cellometer) utilisent le bleu trypan et l’analyse d’image numérique pour compter des centaines de cellules en quelques secondes. Ils réduisent la variabilité entre opérateurs et fournissent des données de distribution de taille. La plupart calculent également la viabilité et peuvent signaler les amas de cellules. Calibrez périodiquement les compteurs automatisés par rapport aux comptages manuels à l’hémocytomètre.

Dosages de Viabilité et de Cytotoxicité

Au-delà du bleu trypan, plusieurs dosages en plaque évaluent la viabilité et la cytotoxicité dans des formats multi-puits :

• Dosage MTT/MTS : les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes réduisent le colorant tétrazolium en formazan coloré (absorbance à 490–570 nm). Le signal est proportionnel au nombre de cellules métaboliquement actives.
• Résazurine (Alamar Blue) : les cellules vivantes réduisent la résazurine en résorufine fluorescente. Non toxique — les mêmes cellules peuvent être mesurées dans le temps.
• Dosage de libération de LDH : la lactate déshydrogénase libérée par les cellules endommagées dans le milieu est mesurée par voie enzymatique (absorbance à 490 nm). Mesure directement la cytotoxicité.
• Dosage ATP (CellTiter-Glo) : mesure luciférase de l’ATP cellulaire. Extrêmement sensible et linéaire sur une large gamme dynamique.

Dosages de Prolifération

• Courbe de croissance : comptez les cellules quotidiennement sur 5–7 jours et tracez le log du nombre de cellules en fonction du temps. Le temps de doublement est calculé à partir de la phase exponentielle.
• Incorporation de BrdU/EdU : les analogues de nucléosides incorporés dans l’ADN pendant la phase S sont détectés par coloration anticorps (BrdU) ou chimie click (EdU). Mesuré par cytométrie en flux, microscopie à fluorescence ou ELISA.
• Dosage SRB (sulforhodamine B) : colore les protéines cellulaires. Les cellules fixées sont colorées avec du SRB, et le colorant lié est solubilisé et mesuré à 510 nm. Excellente linéarité et stabilité.