La culture cellulaire est une technique fondamentale pour étudier la physiologie cellulaire, produire des protéines recombinantes, tester des candidats médicaments et fabriquer des thérapies cellulaires. Le succès dépend de la technique aseptique, de milieux appropriés et de conditions environnementales contrôlées.

Biosécurité et Technique Aseptique

Tout travail de culture cellulaire est effectué dans une enceinte de sécurité biologique de classe II (ESB) en utilisant une technique stérile. L’ESB protège à la fois l’utilisateur et la culture en filtrant l’air à travers un filtre HEPA et en créant un flux d’air laminaire descendant.

Pratiques aseptiques clés :

• Vaporisez tous les articles avec de l’éthanol à 70 % avant de les placer dans l’ESB.
• Ne bloquez pas les grilles d’air à l’avant ou à l’arrière de l’enceinte.
• Travaillez du propre vers le sale — disposez les réactifs d’un côté et les déchets de l’autre.
• Ne touchez jamais l’intérieur d’un bouchon ou le bord d’une bouteille stérile.
• Changez de gants après avoir manipulé des articles non stériles.

Milieux de Croissance

La plupart des cellules de mammifères sont cultivées dans des milieux complexes qui fournissent des nutriments, des facteurs de croissance et un système tampon de pH. Formulations courantes :

• DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) : haute teneur en glucose (4,5 g/L) ou faible teneur en glucose (1 g/L). Utilisé pour HeLa, HEK 293, fibroblastes.
• RPMI-1640 : développé pour les cellules en suspension et les lymphocytes. Couramment utilisé pour les cellules hématopoïétiques et les hybridomes.
• F-12 / Ham’s F-12 : milieu riche pour le clonage sans sérum et les cellules CHO.
• SVF (sérum de veau fœtal) : ajouté à 5–20 % (généralement 10 %) pour fournir des facteurs de croissance, des hormones et des facteurs d’adhésion. La variabilité des lots peut affecter la reproductibilité — testez et réservez un lot cohérent.

Contrôle Environnemental

Les cellules de mammifères sont incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ dans l’air. Le CO₂ se dissout dans le milieu pour former de l’acide carbonique qui, avec le système tampon bicarbonate, maintient le pH à ~7,4. Le bac d’humidification de l’incubateur doit être rempli d’eau stérile et nettoyé régulièrement pour empêcher la croissance de moisissures et de bactéries.

Types de Cellules

• Cellules adhérentes : s’attachent au récipient de culture (par exemple, HeLa, HEK 293, MDCK, fibroblastes primaires). Nécessitent une trypsinisation pour le passage.
• Cellules en suspension : se développent en flottant dans le milieu (par exemple, Jurkat, HL-60, de nombreux hybridomes). Passées par dilution avec du milieu frais.
• Cellules primaires : isolées directement à partir de tissus. Ont une durée de vie finie (limite de Hayflick). Plus pertinentes sur le plan physiologique mais plus difficiles à cultiver.
• Lignées cellulaires immortalisées : dérivées de tumeurs ou transformées in vitro. Peuvent être passées indéfiniment mais peuvent diverger génétiquement du tissu d’origine.

Passage (Subculture)

Les cellules adhérentes sont passées lorsqu’elles atteignent 70–90 % de confluence. Le protocole standard : retirez le milieu, lavez avec du PBS (sans Ca²⁺/Mg²⁺), ajoutez de la trypsine-EDTA, incubez à 37 °C pendant 2–5 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent, ajoutez du milieu frais pour neutraliser la trypsine, comptez et réensemencez à la densité appropriée.

Enregistrez le numéro de passage à chaque fois. Les cellules doivent être utilisées dans une fenêtre de passage définie (par exemple, passages 3–20 pour la plupart des lignées immortalisées) pour minimiser la dérive phénotypique.