Le cycle de l’acide citrique, également connu sous le nom de cycle de Krebs ou cycle TCA, est la plaque tournante centrale du métabolisme cellulaire. Il a lieu dans la matrice mitochondriale et complète l’oxydation des glucides, des graisses et des protéines en convertissant l’acétyl-CoA en dioxyde de carbone.
Comment fonctionne le cycle de l’acide citrique
- Entrée : Formation de citrate
L’acétyl-CoA (dérivé du pyruvate, des acides gras ou des acides aminés) se combine avec l’oxaloacétate, une molécule à quatre carbones, pour former du citrate, une molécule à six carbones. Cette réaction est catalysée par la citrate synthase et est essentiellement irréversible.
- isomérisation et première oxydation
Le citrate est isomérisé en isocitrate via le cis-aconitate intermédiaire. L’isocitrate est ensuite oxydé par l’isocitrate déshydrogénase, libérant la première molécule de CO2 et produisant du NADH. Le produit est de l’alpha-cétoglutarate, une molécule à cinq carbones.
- Deuxième oxydation
L’alpha-cétoglutarate est oxydé par l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase, libérant un deuxième CO2 et produisant du NADH. Cette réaction est similaire à la réaction de la pyruvate déshydrogénase et produit du succinyl-CoA.
- Phosphorylation au niveau du substrat
La succinyl-CoA est convertie en succinate par la succinyl-CoA synthétase. Cette réaction produit du GTP (ou ATP dans certains organismes) par phosphorylation au niveau du substrat, la seule étape du cycle produisant directement de l’ATP.
- Régénération de l’oxaloacétate
Le succinate est oxydé en fumarate par la succinate déshydrogénase, produisant FADH2. Le fumarate est ensuite hydraté en malate, et le malate est oxydé en oxaloacétate par la malate déshydrogénase, produisant un autre NADH. L’oxaloacétate régénéré est prêt à se combiner avec un autre acétyl-CoA.
- Rendement net par tour
Chaque tour du cycle produit :
- 3 NADH
- 1 FADH2
- 1 GTP (ou ATP)
- 2 CO2
Mesure pratique des intermédiaires du cycle TCA
Les intermédiaires du cycle du TCA peuvent être quantifiés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) pour évaluer les flux métaboliques. Récoltez des cellules (1 à 5 × 10⁶) ou des tissus (10 à 50 mg) par trempe rapide dans du méthanol glacé à 80 % pour arrêter le métabolisme. Ajouter un mélange d’étalons internes contenant des isotopologues marqués au ¹³C de citrate, succinate, fumarate, malate et alpha-cétoglutarate (1 nmol chacun). Extraire les métabolites par trois cycles de congélation-dégel dans du méthanol à 80 %, centrifuger à 15 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C et sécher le surnageant sous azote gazeux. Reconstituer dans 50 µL d’eau et injecter 5 µL sur une colonne C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) couplée à un triple quadripôle MS fonctionnant en mode ions négatifs. Séparer avec un gradient d’eau (0,1 % d’acide formique) et d’acétonitrile à 0,3 mL/min pendant 15 minutes. Surveiller les transitions MRM spécifiques : citrate (191 → 111 m/z), succinate (117 → 73 m/z), fumarate (115 → 71 m/z), malate (133 → 115 m/z) et alpha-cétoglutarate (145 → 101 m/z). Pour l’analyse du flux, incuber les cellules avec du [U-¹³C]glucose pendant 6 heures ; le modèle de marquage dans les intermédiaires du TCA révèle les contributions relatives du glucose par rapport à la glutamine en tant que sources de carbone. Vous pouvez également utiliser des inhibiteurs chimiques comme sondes métaboliques : le fluorocitrate (10 à 50 µM) inhibe l’aconitase, bloquant le cycle du citrate et provoquant une accumulation de citrate mesurable par LC-MS dans les 2 heures.
Application du monde réel
Dans une étude sur les lésions d’ischémie-reperfusion dans les cœurs de rats, les intermédiaires du cycle du TCA sont mesurés par LC-MS. Par rapport aux témoins, les cœurs ischémiques présentent une réduction de 60 % du succinate et une multiplication par 3 du fumarate, indiquant un dysfonctionnement du complexe II. Lors de la reperfusion, une explosion d’oxydation du succinate contribue à la production d’espèces réactives de l’oxygène. Ces résultats associent la perturbation du cycle du TCA aux lésions cardiaques et suggèrent le succinate comme cible thérapeutique.
