Alors que CRISPR/Cas9 est utilisé pour éditer des gènes individuels, le criblage CRISPR passe l’ingénierie génomique à l’échelle du génome entier en une seule expérience, identifiant les gènes qui confèrent une résistance, une sensibilité ou un phénotype spécifique.

Principe

Un criblage CRISPR poolé utilise une banque de séquences d’ARN guide unique (sgRNA) ciblant chaque gène du génome (ou un sous-ensemble ciblé). Chaque sgRNA dirige Cas9 pour créer une cassure double brin à un locus génomique spécifique, produisant un knockout. En suivant quels sgRNA sont enrichis ou appauvris dans une population sous sélection, le criblage identifie les gènes fonctionnellement pertinents.

Conception de la Banque

Les banques CRISPR génomiques (Brunello, TKOv3, GeCKO) contiennent 4–6 sgRNA par gène, plus 100–1000 contrôles non ciblants. Chaque sgRNA est une séquence de 20 nt ciblant un site adjacent à PAM dans le génome. La banque est synthétisée sous forme de pool d’oligonucléotides, clonée dans un vecteur lentiviral et encapsidée dans des lentivirus.

Flux de Travail du Criblage

1. Transduction : infecter des cellules exprimant Cas9 avec la banque lentivirale de sgRNA à faible multiplicité d’infection (MOI ~0,3) pour que la plupart des cellules reçoivent un seul sgRNA. Utiliser suffisamment de cellules pour maintenir une représentation ~500× de chaque sgRNA.
2. Sélection : 48 heures après la transduction, ajouter de la puromycine (ou un autre antibiotique de sélection) pour sélectionner les cellules ayant intégré la banque.
3. Sélection phénotypique : après 7–14 jours de propagation, appliquer la condition expérimentale : traitement médicamenteux, exposition à une toxine, privation, ou tri des cellules basé sur un rapporteur. Une population témoin parallèle est cultivée sans sélection.
4. Séquençage : extraire l’ADN génomique des deux populations, amplifier par PCR la région codant le sgRNA et séquencer sur une plateforme Illumina.
5. Analyse : aligner les lectures sur la référence de la banque, compter les sgRNA par gène et calculer le changement de pli entre populations sélectionnées et témoins. Les gènes avec des sgRNA significativement appauvris sont essentiels à la survie ; les sgRNA enrichis indiquent des gènes de résistance.

Considérations Clés

• Représentation : maintenir au moins 500 cellules par sgRNA tout au long du criblage pour éviter les artefacts de perte.
• Expression de Cas9 : les cellules doivent exprimer Cas9 à des niveaux élevés. Les lignées stables exprimant Cas9 ou les lignées knock-in Cas9 sont préférées.
• Contrôles : inclure un contrôle de toxicité (par exemple, une dose élevée du médicament) pour confirmer que l’appauvrissement est spécifique, et un contrôle sans sélection pour tenir compte des effets de croissance des sgRNA eux-mêmes.

Applications

Les criblages CRISPR ont été utilisés pour identifier les mécanismes de résistance aux chimiothérapeutiques, thérapies ciblées et immunothérapies ; découvrir les facteurs hôtes requis pour l’infection virale ; cartographier les interactions létales synthétiques dans le cancer ; et identifier les gènes régulant la différenciation, la migration et le métabolisme cellulaire.

Comparaison avec les Criblages shRNA

Les criblages CRISPR créent des knockouts complets (mutations de décalage du cadre de lecture) plutôt que des knockdowns (dégradation d’ARNm), donnant une perte de fonction plus cohérente et complète. Ils ont moins d’effets hors cible que les shRNA en raison de la séquence cible plus longue (20 nt vs. 19 nt) et de l’exigence d’une séquence PAM. Cependant, les criblages CRISPR sont limités aux gènes codant des protéines, tandis que les criblages shRNA peuvent cibler les ARN non codants.