La cryoconservation est le processus de préservation de cellules vivantes, de tissus ou de micro-organismes à des températures ultra-basses (généralement −80 °C ou −196 °C dans l’azote liquide) afin qu’ils restent viables pour une utilisation future. Une banque cellulaire bien gérée assure la reproductibilité expérimentale sur des années.

Principes

La formation de cristaux de glace est la principale cause de mort cellulaire pendant la congélation. Les cristaux de glace intracellulaires percent les membranes et perturbent les organites. Les agents cryoprotecteurs (CPA) protègent les cellules en :

• Pénétrant la cellule (par exemple, DMSO, glycérol) pour déplacer l’eau et abaisser le point de congélation.
• Non pénétrants (par exemple, saccharose, Ficoll) pour déshydrater les cellules avant la congélation.

La vitesse de refroidissement doit équilibrer deux effets concurrents : trop lente provoque des dommages osmotiques dus à une exposition prolongée à des solutés concentrés ; trop rapide provoque de la glace intracellulaire létale. La plupart des cellules de mammifères sont optimalement refroidies à −1 °C par minute.

Cryoprotecteurs

• DMSO (diméthylsulfoxyde) : le CPA le plus utilisé. La concentration typique est de 5–10 % (v/v) dans du milieu de culture avec 10–20 % de SVF ou un milieu de congélation sans sérum. Le DMSO est toxique pour les cellules à température ambiante avec le temps — travaillez rapidement et maintenez les cellules sur glace.
• Glycérol : 10–20 % (v/v). Moins toxique que le DMSO mais moins pénétrant. Couramment utilisé pour les bactéries, les levures et certaines lignées cellulaires.
• Milieux de congélation sans sérum : formulations commerciales (par exemple, CryoStor, Recovery Cell Culture Freezing Medium) utilisent des CPA définis sans sérum animal.

Protocole de Congélation

1. Récoltez les cellules en phase logarithmique avec une viabilité >90 %.
2. Comptez et centrifugez à 200–300 × g pendant 5 minutes.
3. Resuspendez dans du milieu de congélation froid à 1–5 × 10⁶ cellules/mL.
4. Distribuez dans des cryotubes (1 mL par tube). Étiquetez avec la lignée cellulaire, le numéro de passage, la date et l’opérateur.
5. Refroidissez à −1 °C/min en utilisant un congélateur à vitesse contrôlée, un conteneur de congélation à isopropanol (Mr. Frosty) ou un dispositif de refroidissement passif.
6. Transférez à −80 °C pendant 24 heures (court terme), puis déplacez dans l’azote liquide (−196 °C) pour le stockage à long terme.

Protocole de Décongélation

1. Retirez le tube du stockage et placez-le immédiatement dans un bain-marie à 37 °C avec agitation douce.
2. Décongelez jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit cristal de glace (environ 1–2 minutes).
3. Essuyez le tube avec de l’éthanol à 70 %.
4. Transférez le contenu goutte à goutte dans 10 mL de milieu de culture préchauffé.
5. Centrifugez à 200 × g pendant 5 minutes pour éliminer le DMSO, resuspendez dans du milieu frais et ensemencez.

Cryoconservation Bactérienne et de Levures

Les bactéries et les levures sont plus simples à conserver. Mélangez une culture de nuit 1:1 avec du glycérol stérile à 50 % dans un cryotube, vortexez et congelez à −80 °C. Pour la récupération, grattez la surface du stock congelé avec une anse stérile et striez sur une gélose — ne décongelez pas la totalité du stock.

Bonnes Pratiques de Banque Cellulaire

• Créez une Banque Cellulaire Maître (BCM) au numéro de passage le plus bas possible, puis dérivez des Banques Cellulaires de Travail (BCT) à partir de la BCM.
• Testez les BCM pour les mycoplasmes, la contamination bactérienne et l’identité (profilage STR pour les lignées cellulaires humaines).
• Stockez les tubes BCM dans deux emplacements physiquement séparés.
• Surveillez les niveaux d’azote liquide et maintenez un journal de température.